膀胱尿路上皮癌组织中DNMT1、HMGA2的表达及临床意义

魏福奎+王耀锋

[摘要] 目的 檢测膀胱尿路上皮癌（BUC）组织中DNA甲基转移酶1（DNMT1）、高迁移率族蛋白A2（HMGA2）的表达情况，并探讨其临床意义。 方法 2010年1月～2012年6月在西安医学院附属宝鸡医院泌尿外科收集BUC癌组织89例和正常膀胱组织45例，免疫组化SP法检测各组织中DNMT1、HMGA2蛋白的表达，分析DNMT1、HMGA2蛋白表达与BUC患者临床病理参数及预后的关系。 结果 DNMT1蛋白在BUC癌组织和正常膀胱组织中的阳性表达率分别为70.79%（63/89）和6.67%（3/45），差异有统计学意义（P < 0.05）；HMGA2蛋白在BUC癌组织和正常膀胱组织中的阳性表达率分别为65.17%（58/89）和2.22%（1/45），差异有统计学意义（P < 0.05）。BUC癌组织中，DNMT1蛋白异常表达与患者肿瘤直径、有无淋巴转移和肿瘤临床分期有关（P < 0.05）；HMGA2蛋白异常表达与患者肿瘤直径、组织分化程度和肿瘤临床分期有关（P < 0.05）。DNMT1阳性患者的生存时间明显短于DNMT1阴性患者（χ2=9.634，P = 0.002）；HMGA2阳性患者的生存时间显著低短于HMGA2阴性患者（χ2=4.911，P = 0.027）。 结论 在BUC癌组织中，DNMT1、HMGA2蛋白呈高表达状态，且均在BUC的肿瘤发生和恶性进展中发挥重要作用，DNMT1、HMGA2可作为BUC预后预测和治疗的潜在靶点。

[关键词] 膀胱尿路上皮癌；DNA甲基转移酶1；高迁移率族蛋白A2；病理参数；预后

[中图分类号] R737.14；R737.15 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（c）-0078-04

Expression of DNMT1 and HMGA2 in the bladder urothelial carcinoma tissues and their clinical significance

WEI Fukui WANG Yaofeng

Department of Urology Surgery， Baoji Affiliated Hospital of Xi'an Medical University， Shaanxi Province， Baoji 721006， China

[Abstract] Objective To detect the protein expressions of the DNA methyltransferase 1 （DNMT1） and high mobility group protein A2 （HMGA2） in the bladder urothelial carcinoma （BUC） tissues and to investigate their clinical significance. Methods From January 2010 to June 2012， 89 cases of BUC cancer tissues and 45 cases of normal bladder tissues were collected from Department of Urology Surgery of Baoji Affiliated Hospital of Xi'an Medical University. The immunohistochemical SP method was used to detect the protein expression of DNMT1 and HMGA2 in each tissue. In addition， the relationship between the protein expression of DNMT1/HMGA2 and the clinical pathologic characteristics and prognosis was analyzed. Results The positive expression rate of DNMT1 in BUC cancer tissues and normal bladder tissues was 70.79% （63/89） and 6.67% （3/45）， respectively （P < 0.05）. The positive expression rate of HMGA2 in BUC cancer tissues and the normal bladder tissues was 65.17% （58/89） and 2.22% （1/45）， respectively （P < 0.05）. In BUC cancer tissues， the DNMT1 protein expression was correlated with the tumor diameter， lymph node metastasis status and the clinical stages （P < 0.05）， while the HMGA2 protein expression was correlated with the tumor diameter， differentiation grades and the clinical stages （P < 0.05）. The DNMT1-positive patients' survival time was much shorter than the DNMT1-negative patients （P < 0.05）， while the HMGA2-positive patients' survival time was much shorter than the HMGA2-negative patients （P < 0.05）. Conclusion In BUC cancer tissues， the DNMT1 and HMGA2 are both highly expressed， which may play critical roles in the tumor genesis and the development of BUC. DNMT1 and HMGA2 may serve as biomarkers for the prognosis and the therapy of BUC.endprint

[Key words] Bladder urothelial carcinoma； DNA methyltransferase 1； High mobility group protein A2； Pathological characteristics； Prognosis

表观遗传不稳定性在肿瘤形成和恶性进展中扮演着重要的角色[1]，表观遗传的调节机制主要有DNA甲基化、组蛋白修饰（组蛋白甲基化、去乙酰化等）、RNA编辑等[2]。DNA甲基化是在DNA转移酶（DNMTs）的催化下完成的，DNMTs主要有3种，即DNMT1、DNMT3a和DNMT3b，其中DNMT1主要参与维持DNA的甲基化状态，DNMT3a和DNMT3b在DNA甲基化的重头合成过程中发挥作用[3]。研究表明，DNMT1在包括膀胱癌等多种肿瘤细胞中表达增加[4]。

高迁移率族蛋白（HMG）是在真核生物中广泛存在的一类染色质相关蛋白，主要包括HMGA、HMGB和HMGN等家族成员，HMGA2属于HMGA亚家族，是一种建筑转录因子，在细胞的多种生理过程中发挥作用，如细胞增殖、分化以及细胞周期等[5]。HMGA2在胚胎期及分化程度低的组织中大量表达，而在分化程度高的组织中，几乎不表达[6]。大量研究证实，HMGA2在多种肿瘤细胞中呈现高表达状态，如肺癌[7]、乳腺癌[8]和胰腺癌[9]等。有文献报道，膀胱癌细胞中存在HMGA2转录和翻译水平的表达增加，且HMGA2表达是膀胱癌复发和恶性进展的潜在预测靶标[10]。

本研究采用免疫组化SP法检测DNMT1和HMGA2蛋白在膀胱尿路上皮癌（BUC）组织及正常膀胱组织中的表达情况，并分析DNMT1和HMGA2蛋白表达与BUC患者临床病理参数、预后的关系，探讨其与BUC肿瘤发生及恶性进展的关系，以期为BUC患者的临床诊断和治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年1月～2012年6月西安医学院附属宝鸡医院接受手术治疗的BUC患者89例，其中男34例，女55例；年龄≤50岁患者23例，>50岁患者66例；肿瘤直径>3 cm者63例，≤3 cm者26例；肿瘤低分化者54例，中高分化者35例；有淋巴结转移71例，无淋巴结转移18例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期64例。纳入标准：具有完整的病例资料，且均行膀胱全切术，签署知情同意书，病理诊断为BUC。排除标准：合并其他恶性肿瘤、全身感染性疾病、肝肾疾病。另收集45例正常膀胱组织作为对照组。本研究经医院伦理委员会审核同意。

1.2 试剂与方法

兔抗人DNMT1多克隆抗体（美国Santa公司），兔抗人HMGA2多克隆抗体（美国Santa公司），抗体稀释度均为1∶100；生物素二抗（南京金斯瑞生物科技有限公司），稀释比1∶200；超敏SP试剂盒，DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），苏木精染液（南京赛泓瑞生物科技有限公司）。

所有组织样本经10%甲醛固定，石蜡包埋，按5 μm厚切片；经二甲苯脱蜡，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，在98℃的枸橼酸钠溶液（0.01 mol/L，pH 6.0）中浸泡15 min进行抗原修复，滴加正常山羊血清室温封闭15 min，弃去血清，分别滴加DNMT1和HMGA2一抗工作液，37℃孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加生物素二抗，室温孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，DAB显色，充分冲洗后，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

每例标本均选择10个含有阳性细胞的高倍视野（400×）分别计数100个肿瘤细胞，取其平均值计算阳性细胞百分率。按阳性细胞百分率判定：无阳性细胞为0分；≤25%为1分；>25%～50%为2分；>50%为3分。按染色程度判定：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分。染色指数为阳性细胞百分率与染色强度之和：最小值0分，最大值6分。>3分判定为阳性，≤3分定为阴性。

1.4 随访

采用电话或者门诊的方式进行随访。随访时间为患者确诊后1～60个月，直至患者死亡或者随访时间截止。

1.5 统计学方法

所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行統计学分析，计数资料比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNMT1和HMGA2蛋白在不同膀胱组织中的表达情况

DNMT1蛋白阳性表达主要定位于细胞核，HMGA2阳性表达主要定位于细胞质和细胞核，DNMT1、HMGA2蛋白在BUC癌组织中阳性率分别为70.79%、65.17%，均高于正常膀胱组织中的6.67%、2.22%，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1、图1（封四）。

2.2 DNMT1和HMGA2蛋白表达与BUC患者临床病理参数的关系

BUC癌组织中DNMT1蛋白表达与患者性别、年龄和组织分化程度无关（P > 0.05），与患者肿瘤直径、有无淋巴转移和临床分期有关（P < 0.05）；HMGA2蛋白表达与患者性别、年龄和淋巴转移情况无关（P > 0.05），与患者肿瘤直径、组织分化程度和临床分期有关（P < 0.05）。见表2。

2.3 BUC癌组织中DNMT1和HMGA2蛋白表达与患者预后的关系

BUC癌组织DNMT1阳性表达63例中，生存时间>5年21例（33.33%），DNMT1阴性表达26例中，生存时间>5年18例（69.23%），DNMT1阳性患者的生存时间显著低于DNMT1阴性患者（χ2=9.634，P = 0.002）；BUC癌组织HMGA2阳性表达58例中，生存时间>5年25例（43.10%），HMGA2阴性表达31例中，生存时间>5年21例（67.74%），HMGA2阳性患者的生存时间显著低于HMGA2阴性患者（χ2=4.911，P = 0.027）。endprint

3 討论

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是泌尿生殖系统发病率和病死率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类的生活质量和生命安全[11]。最新流行病学调查研究显示，大约90%的膀胱癌来源于尿路上皮细胞，即BUC，BUC发病率逐年升高，且发病呈年轻化趋势，已成为威胁人类健康的重要疾病之一[12]。BUC临床表现复杂，其发生发展是多因素共同参与的过程，目前，关于BUC的分子生物学研究越来越多，但BUC的诊疗方案并未有突破性的进展，因此从分子水平探究BUC肿瘤发生和恶性进展的内在机制，寻找有价值的分子标志物，是临床上亟需解决的难题之一。

近年来，表观遗传学在肿瘤形成及恶性进展中发挥的作用，受到越来越多的关注。DNA甲基化是表观遗传的调节机制之一，参与多种生理病理过程[13-14]。DNMT1在胃癌[15]、前列腺癌[16]等多种肿瘤细胞中存在过量表达，且DNMT1抑制剂在肿瘤治疗中的研究已进入临床试验阶段[17]。本研究结果发现，DNMT1蛋白在BUC癌组织中的阳性表达率显著高于正常膀胱组织，在肿瘤直径较大、存在淋巴转移、临床分期较高（Ⅲ+Ⅳ期）患者的BUC癌组织中的阳性表达率较高，以上结果提示，DNMT1蛋白在BUC癌组织中过量表达，且其表达增加预示着患者可能存在淋巴转移和较高的临床分期，预示着患者可能存在不良预后，与Wu等[18]在膀胱癌中对DNMT1的研究结论一致，DNMT1可以作为膀胱癌预后判断的潜在靶标；此外，Dhawan等[19]的研究结果证实，DNMT1可作为侵袭性泌尿道上皮肿瘤的治疗靶标。

Shi等[20]在膀胱癌细胞中沉默HMGA2基因表达后，发现细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化等过程均被抑制。本研究采用免疫组化SP法检测HMGA2蛋白在BUC癌组织和正常膀胱组织中的表达，结果显示HMGA2蛋白在BUC癌组织中的阳性表达率显著高于正常膀胱组织，提示在BUC癌组织中HMGA2蛋白表达增加，Yang等[10]的研究结果也证实，在BUC癌组织中，HMGA2蛋白表达增加。此外，本研究结果发现，HMGA2蛋白在肿瘤直径较大、肿瘤分化程度较低、临床分期较高（Ⅲ+Ⅳ期）患者的BUC癌组织中的阳性表达率较高，提示HMGA2蛋白表达增加的BUC患者，其癌组织低分化以及处于较高临床分期的概率更高，与Ding等[21]的研究结果类似，在膀胱癌细胞中，HMGA2蛋白表达增加可以作为肿瘤恶性进展的预测指标之一。

本研究进一步分析了DNMT1和HMGA2蛋白表达与BUC患者预后的关系，结果显示，DNMT1阳性患者的生存时间显著低于DNMT1阴性患者，HMGA2阳性患者的生存时间显著低于HMGA2阴性患者，提示在BUC癌组织中，高表达DNMT1和HMGA2可以作为BUC患者不良预后的潜在靶标。

综上所述，本研究结果表明，DNMT1和HMGA2蛋白在BUC癌组织中的阳性表达率均显著高于正常膀胱组织，并且在BUC癌组织中，DNMT1蛋白表达与BUC患者的肿瘤直径、淋巴结转移状态和临床分期有密切关系，而HMGA2蛋白表达与BUC患者的肿瘤直径、肿瘤分化程度态和临床分期有密切关系，且DNMT1和HMGA2蛋白高表达可以作为预测BUC患者不良预后的潜在指标，提示DNMT1、HMGA2可能参与了BUC肿瘤发生和恶性进展过程，联合检测DNMT1、HMGA2对BUC患者的诊断、治疗和预后判断具有重要的临床意义。

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（收稿日期：2017-08-04 本文編辑：张瑜杰）endprint