穿心莲内酯高压液相色谱纯化技术研究

孙宝胜　徐存宽　薛云才　吴本刚

摘要：以穿心莲提取物为试验原料，采用动态轴向压缩制备色谱技术进行分离纯化，以制备高纯度穿心莲内酯。制备柱装填纯化材料：硅胶基质C18 10 μm，装填质量300 g，实测柱床规格50 mm×250 mm。以甲醇水为流动相进行纯化工艺优化，结果表明，甲醇水体系下水相添加005 molL乙酸铵能促进穿心莲内酯的溶解，该体系下穿心莲内酯最佳纯化工艺条件：流动相55%甲醇水+45% 005 molL乙酸铵缓冲液，流速600 mLmin；检测波长254 nm，温度为室温。

关键词：穿心莲内酯；分离纯化；制备色谱；工艺优化

中图分类号： R2842文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0202-03

收稿日期：2016-05-25

基金项目：江苏省自然科学基金青年基金（编号：20150500）；江苏大学高级人才科研启动基金（编号：15JDG070）。

作者简介：孙宝胜（1983—），男，山东菏泽人，硕士，助理工程师，主要从事药食同源植物活性成分提取分离技术以及功能活性评价研究。Tel：（0523）86086656；E-mail：s_baosheng@163com。

通信作者：吴本刚，博士研究生，讲师，主要从事食品功能成分提取及其活性评价研究。Tel：（0511）88795305；E-mail：wubg@ujseducn。

穿心莲Andrographis paniculata（Burm f） Nees]为爵床科（Acanthaceae）穿心莲属（Andrographis Wall ex Nees）植物，别称一见喜、苦草、四方草、印度草等1]，在中国、印度、马来西亚等国具有悠久的民间药用史，在国内主要分布在广东省、广西壮族自治区、福建省、四川省等省（区），以广西壮族自治区种植面积最大2]。

穿心莲植株所含穿心莲内酯是目前穿心莲制剂的主要活性成分3]，其分子式为C20H30O5，在穿心莲叶中含量高达 184%。现代药理研究表明，穿心莲内酯具有抗炎抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、治疗心脑血管疾病、保肝利胆、抗肿瘤等作用，具有毒性小、价格低的特点。穿心莲具有清热解毒、凉血、消肿等功效，在临床上用于治疗呼吸道感染、急性菌痢、肠胃炎等疾病4-5]，还具有防治心血管疾病、抗肿瘤、保肝利胆、免疫调节等多重功效6-7]，在我国已作为穿虎宁、穿心莲注射液等解热镇痛药的原料大量生产8-9]。

穿心莲内酯提取主要采用乙醇直接提取法、水提法、超声波輔助提取法、酶解辅助提取法等方法，在此基础上进一步采用大孔树脂吸附和结晶等方法进一步纯化10]。范云鸽等采用ADS-7树脂对传统的乙醇回流提取液进行纯化，分离干燥后得到的浸膏中穿心莲内酯含量达253%11]。本试验原料为穿心莲经乙醇水提取、大孔树脂纯化后粗品，在此基础上采用反相高压液相色谱对其进一步纯化，优化工艺条件以获得高纯度的产品，旨在为穿心莲内酯的精制提供工艺参考。

1材料与方法

11试剂

甲醇（AR），国药集团化学试剂有限公司生产；娃哈哈牌饮用纯净水，自制去离子水；乙酸铵（AR），国药集团化学试剂有限公司生产；9958%穿心莲内酯对照品，46%穿心莲内酯乙醇水粗提物。

12仪器及设备

Waters 2695—2998高效液相色谱仪；Waters Sunfire C18 5 μm 46 mm×250 mm色谱柱，柱恒温箱；创新牌制备型50DAC液相色谱仪；装填普通C18填料色谱柱300 g，实测柱床高度250 mm，柱床直径50 mm；万分之一分析天平（赛多利斯公司）；超声波清洗机。

13试验方法

131标准曲线建立

标准曲线测试液相方法：Waters 2695—2998高效液相色谱仪，Sunfire C18 46 mm×250 mm柱，流动相甲醇 ∶水=55 ∶45，水相中含有01%乙酸，进样体积5 μL，柱温度25 ℃，流速1 mLmin，以质量浓度为横坐标和峰面积为纵坐标作标准曲线。

准确称取0010 0 g纯度9958%对照品，用甲醇定容至50 mL，超声混匀，配制020 mgmL标准液，依次稀释得到 020、010、006、004、002 mgmL梯度标准溶液，进Waters液相测试，鉴于该物质溶解度较低，故采取增大进样体积方式增大进样量，分别进样10 μL和15 μL作为 04 mgmL 和06 mgmL浓度标准曲线点。

132甲醇水流动相体系下保留时间优化

为考察穿心莲内酯在该C18柱甲醇水体系下的保留性能，用穿心莲对照品做试验样品考察合适该物质的甲醇比例。试验初始条件：流速600 mLmin，定量环进样300 μL，波长254 nm，温度为室温。

穿心莲内酯溶解较差，相对其他有机试剂，其在甲醇、乙醇中溶解性相对较好。从可行性和经济方面考虑，本试验有机相优先考虑甲醇。因该部分试验主要考察穿心莲内酯保留时间，故试验样品采用对照品，可以有效节约色谱系统净化时间和保护色谱系统。

根据文献资料和该物质理化性质，选用70%、60%、52%、50%甲醇水流动相比例进行试验。考察穿心莲内酯在试验条件下的保留时间参数，得出在该纯化填料下较为合理的保留时间。

133穿心莲内酯溶解量优化

由前期试验可知，制备时甲醇比例50%～60%为宜，该条件下穿心莲内酯保留时间在 12～28 min。色谱纯化过程工艺中，样品的溶解性决定制备效率，因而有必要对穿心莲内酯的溶解性进一步优化。本试验中，样品采用50%甲醇水溶解，在水相中加入005 molL乙酸铵改变溶液理化性质，以期增大其溶解度。endprint

配制50%甲醇、50%乙酸铵水溶液，取7支规格50 mL离心管，标号0、1、2、3、4、5、6，0号加入20 mL 50%甲醇水和 400 mg 原料药，1～6号分别加入50%乙酸铵水混合溶液 20 mL，依次加入46%粗品原料100、200、300、400、600、1 200 mg，充分摇匀并超声促溶3 min，取出密闭静置过夜。次日以8 400 rmin离心10 min，取上清液，过 022 μm 有机滤膜，分别上Waters液相测试，每组做3个平行，根据标准曲线计算溶解度。

134制备优化试验

以纯度46%穿心莲为原料，以甲醇+乙酸铵水溶液（005 molL）为流动相，根据杂质分离情况对流动相甲醇比例进行适当再优化。

46%粗品溶解液：根据“133”节试验结果，采用最大溶解方式溶解，过045 μm滤膜过滤备用。

2结果与分析

21标准曲线

以穿心莲内酯质量浓度为横坐标，以对应浓度条件下色谱峰面积为纵坐标作标准曲线。

由图1可知，穿心莲内酯在002～060 mgmL浓度范围内线性关系良好，相关系数r2为0999 9。

22流动相中有机相甲醇比例优化

根据已知文献以及穿心莲内酯在C18柱上的保留性质，在优化流动相时，优先使用70%甲醇水流动相作为洗脱条件。

由图2可知，70%甲醇水条件下保留时间为83 min，保留时间较短，若作为粗品的纯化方法则易出现目标物与杂质分离度小的情况，故有必要进一步降低甲醇比例，增大保留时间。60%、52%、50%甲醇流动相条件下的色谱分别如图3、图4、图5所示。

分析色谱图（图3至图6）可知，60%、52%、50%甲醇流动相条件下，穿心莲内酯的保留时间分别为1303、2300、2760 min。由此可知，甲醇比例在50%～60%时，穿心莲内酯保留时间为 12～28 min，保留时间适中。该甲醇比例条件下，制备周期较短且有可能获得较好的分离度。综合分析各条件下穿心莲内酯保留时间，暂将52%甲醇水流动相作为进一步优化的基础条件，并在此基础上进行后续试验。

23穿心莲内酯溶解量试验

根据“133”节溶解量试验方案，得出各物料比条件下穿心莲内酯的浓度。由表1可知，20 mL混合溶液加入 600 mg 原料时，穿心莲内酯溶解度达416 mgmL。

以50%甲醇、50%乙酸铵水溶液为溶剂，加入1200 g 46%的原料药和20 mL溶剂，常温下得到530 mgmL穿心莲内酯溶液。乙酸铵、甲醇水溶液溶解样品后得到澄清色液体，甲醇水溶液条件下得到的溶液浑浊，呈现青黄色且透光度较差，说明在甲醇水溶液基础上，加入乙酸铵能有效提高物质的溶解性。

24制备条件下甲醇乙酸铵水优化试验

根据“22”节试验，初步确立52%甲醇水基础流动相；由“23”节试验结果可知，在甲醇水乙酸铵体系下，穿心莲内酯粗溶解浓度较好。以该溶液作为色谱制备工艺进样原料，在此流动相和溶解量基础上进一步对工艺进行优化。

“22”节试验已经研究了甲醇比例对穿心莲内酯溶解度的影响，因而本次试验只在原来基础上进行细微优化。首先考察52%甲醇水乙酸铵体系下穿心莲内酯粗品分析图谱，进样体积和检测波长等参数不变。

由图6分析可知，穿心莲内酯保留时间2250 min，但目标峰后存在一明显杂质峰且分离度较差，不利于制备分离纯化。

前期试验结果表明，提高流动相中甲醇的比例，穿心莲内酯保留时间变短。由图6可知，目标物质峰和前杂质峰分离度较好，因此将流动相中甲醇比例提高到55%，乙酸铵水溶液比例为45%，其他条件不变，进样分析。

由图7可知，该制备条件下主峰与杂质峰分离效果较好，杂质峰4和峰6与目标物质分离度大，且目标峰保留时间为175 min，故该流动相条件下目标物质有效分离且缩短了制备时间。

25制备工艺放大试验

使用“23”节中6号溶解液，穿心莲内酯含量约为 530 mgmL；流动相：55%甲醇、45% 005 molL乙酸铵缓冲液；模拟制备色谱柱：某公司C18 10 μm 46 mm×250 mm。穿心莲内酯溶解量不高，故放大试验采取增大上样体积的方式。进样120 mL，得制备色谱如图8所示。

收集穿心莲整峰，进样测定，按峰面积归一化法计算，穿心莲内酯含量9990%，因收集整个主峰，故而回收率接近100%。

当进样120 mL时，制备回收率和目标物质纯度均较高，为提高制备效率，需进一步增大上样体积，以提高上样量。其他参数不变条件下进样1200 mL，得图9所示色谱图。

如图9所示，制备时按下述方法收集：收集峰1峰起至后峰肩馏分并标号为F1；收集峰1后峰肩至峰尾馏分并标号为F2。

按峰面积归一化法计，馏分F1穿心莲内酯含量为 9927%，有效回收率占8600%（图10）。F2馏分内酯含量为8900%，后杂质含量为1084%，根据峰面积粗略计算，该段馏分中穿心莲内酯占总内酯的2%。

3结论

穿心莲内酯在002～060 mgmL浓度范围内线性关系良好，相关系数为0999，可用于穿心莲内酯定量分析。

经甲醇乙酸铵水体系优化，穿心莲内酯溶解度有效提高，溶解量达到530 mgmL。

常温制备条件下，纯穿心莲内酯上样体积1200 mL，上样量为6360 mg，上样量占柱填料质量百分比约为02%。馏分中穿心莲内酯纯度9927%，回收率为8600%。

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