白背毛木耳液体发酵条件优化

刘敏　刘鹏冀　赵玉涛　卢红

摘要：以白背毛木耳为试验材料，采用液体摇瓶培养法，通过单因素试验、正交试验，以菌丝体生物量为主要指标，对白背毛木耳液体发酵培养基配方及培养条件进行优化。结果表明，白背毛木耳适宜的液体培养基配方为200%马铃薯、20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4；白背毛木耳液体培养适宜的条件：培养温度为25 ℃、摇床转速为180 rmin、装液量为100 mL（250 mL三角瓶）、发酵终点为4 d。

关键词：白背毛木耳；液体培养基；发酵条件；菌丝体鲜质量；优化

中图分类号： S646604+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0149-03

收稿日期：2016-09-28

基金项目：河北省科技支撑计划（编号：16237301D-2-10）。

作者简介：刘敏（1985—），女，河北石家庄人，硕士，实验师，从事食药用真菌研究与开发工作。E-mail：liumin870115@163com。

白背毛木耳（Auricularia polytricha）隶属于担子菌亚门层菌纲木耳目木耳科木耳属中的毛木耳种。按照背部绒毛层颜色不同，毛木耳分为白背毛木耳和黄背毛木耳2个商业化栽培品种。毛木耳口感脆滑，风味独特，胶质含量丰富，素有“树上海蜇皮”之美称。毛木耳营养丰富，据分析，100 g毛木耳干品中含有70～91 g粗蛋白质、06～ 12 g粗脂肪、646 ～ 692 g碳水化合物、1 2301～1 3347 kJ 热量、97～143 g粗纤维、21～42 g灰分、001 mg 胡萝卜素、009～036 mg硫胺素、704～835 mg抗坏血酸以及17～40 mg尼克酸1]。另外，毛木耳还具有较高的药用价值，入药有益气强身、活血、止血、止痛之功效2-3]。

毛木耳是一种著名的药食兼用的蕈菌，在我国栽培的历史悠久，是极具商业开发价值的木耳品种之一4]。毛木耳是一种高温腐生型菌类，易栽培，既可鲜销又可干售，适合高温季节栽培，正好可以弥补夏季蔬菜市场上鲜品菇类供应的不足，亦可作为食用菌周年栽培生產的一个配套品种，是当前我国广泛栽培的食用菌之一。目前，毛木耳生产过程中大多使用的是固体菌种，与固体菌种相比，液体菌种具有菌龄一致、生长速度快、生产周期短、接种方便、无季节性、适宜工厂化生产等优势，因此在食用菌生产中具有广阔的应用前景5-6]。

目前有关毛木耳液体发酵条件尚未见系统的研究，因此，本研究采用液体摇瓶培养法，以菌丝体鲜质量为指标，通过碳、氮源单因素试验并结合L9（34）正交试验方法，对白背毛木耳液体发酵过程中的培养基配方及培养条件进行优化，筛选出白背毛木耳最适宜的液体培养基，旨在为白背毛木耳菌种生产、紫外诱变育种以及液体发酵活性物质提取等方面的研究提供理论依据和技术支持。

1材料与方法

11试验材料

111供试菌株

白背毛木耳菌株为川耳1号，由河北大学食药用真菌研究所保藏。

112培养基

（1）PDA培养基：20%马铃薯、2%葡萄糖、2%琼脂，pH值自然。

（2）一级液体培养基、基础二级液体培养基：200%马铃薯、20%葡萄糖、10%蛋白胨、01%MgSO4·7H2O、01% KH2PO4。

（3）栽培培养基：84%杂木屑，15%麸皮，1%生石灰。

12试验方法

121JP3]白背毛木耳试管母种扩繁

按常规方法制备PDA培养基后，121 ℃高压灭菌30 min，冷却后，通过无菌操作进行接种，于25 ℃恒温培养箱中进行黑暗培养，待试管中菌丝长满，备用。

122一级液体菌种的制备方法

按常规方法制备一级液体培养基，分装于250 mL三角瓶中，装液量为100 mL，121 ℃高压灭菌30 min，待冷却后，取活化的菌种在无菌条件下进行接种，接种后放入恒温摇床中25 ℃、160 rmin恒温振荡培养6 d，制得白背毛木耳一级液体菌种，备用。

123碳源的选择

固定其他成分不变，分别用蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉代替基础二级液体培养基中的葡萄糖作为培养基的碳源，浓度均为20%，250 mL三角瓶中装液量为 100 mL，121 ℃灭菌30 min，接种量为10%，放入 25 ℃、160 rmin 摇床内振荡培养6 d，测定菌丝体鲜质量，每个处理3次重复。菌丝体鲜质量测定方法7]：以80目铜丝网过滤称质量，鲜质量的测定可以实时检测菌种的发酵动态，是较干质量测定更为实用的快速测定方法。

124氮源的选择

固定其他成分不变，分别用麸皮、酵母粉、硫酸铵代替基础二级液体培养基中的蛋白胨作为培养基的氮源，浓度均为10%，250 mL三角瓶中装液量为100 mL，121 ℃ 灭菌30 min，接种量为10%，放入25 ℃、160 rmin摇床内振荡培养6 d，测定菌丝体鲜质量，每个处理3次重复。

125碳源、氮源正交试验

以葡萄糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4为试验因素，设计L9（34）正交试验，试验因素水平如表1所示，以菌丝体鲜质量为指标，共计9个处理，每个处理3次重复。

126温度的选择

接种菌种后，将三角瓶分别置于19、22、25、28、31 ℃温度下160 rmin振荡培养6 d后，测定菌丝体鲜质量。

127摇床转速的选择

接种菌种后，摇床转速分别设置为160、170、180、190、200、210 rmin，在上述试验选出的最佳温度下振荡培养6 d后，测定菌丝体鲜质量。endprint

128装液量的选择

配制基础二级液体培养基时分别在 250 mL 三角瓶中装入70、80、90、100、110、120 mL的培养基，接种菌种后，在上述试验选出的最佳温度及上述试验最佳摇床转速条件下振荡培养6 d后，测定菌丝体鲜质量。

129发酵终点的确定

1291白背毛木耳液体发酵过程中相关指标的检测

接种后，将三角瓶置于25 ℃、160 rmin的恒温摇床中，发酵开始后每隔24 h取出3瓶测定菌丝体的鲜质量和发酵液pH值，确定最佳发酵时间。

1292回接试管法萌发试验

根据液体发酵曲线的情况，试验中从液体发酵的第4天至第7天，每天上午10：00取样，取样后接种到斜面培养基上，25 ℃恒温黑暗培养，记录回接试管后菌丝的萌发时间。以菌丝体鲜质量及回接试管后菌丝萌发情况作为主要评价指标，确定白背毛木耳液体发酵终点。

1210液体菌种应用比较

分别将白背毛木耳固体菌种和液体菌种接种于栽培培养基中，25 ℃恒温培养，培养过程中观察并记录满袋时间、菌丝长势、白背毛木耳的子实体农艺性状和生物学效率等（每袋装干料1 000 g）。

13数据分析

试验数据采用Excel和SPSS软件进行处理和分析。

2结果与分析

21碳源对白背毛木耳液体菌丝体培养的影响

碳源是食用菌培养基的主要营养成分之一，碳素是构成食用菌细胞和代谢产物中碳架来源的营养物质，也是食用菌的生命活动所需要的能源。相关研究表明，碳源主要对细胞生长和活性生物成分的合成有较大的影响8-9]。由表2可知，白背毛木耳对4种碳源均有不同程度的利用，以菌丝体鲜质量为指标来看，其中葡萄糖的利用率最高，可溶性淀粉次之，蔗糖最差。在4种供试的碳源中，发酵培养基最佳碳源为葡萄糖，菌丝体鲜质量可达25432 7 g100 mL，并且与其他3种碳源的菌丝体鲜质量差异显著（P<005），其余3个碳源（可溶性淀粉、蔗糖和玉米粉）尽管在发酵后菌丝体鲜质量有所不同，但是经过统计学分析并无显著性差异。因此，选择葡萄糖作为白背毛木耳液体发酵的主要碳源并进行后续的碳源、氮源正交试验。

22氮源对白背毛木耳液体菌丝体培养的影响

氮源是食用菌细胞合成蛋白质和核酸必不可少的主要原料，一般不供作能量来源，通常分为无机氮和有机氮2类。由表3可知，氮源对白背毛木耳菌丝体生物量的影响有一定的差异。在4种供试氮源中，麸皮和酵母粉的发酵效果较好，发酵结束后菌丝体鲜质量较高，并且两者之间无显著性差异，因此麸皮和酵母粉均可以作为白背毛木耳液体发酵时的氮源来使用。由于酵母粉为氮源时培养白背毛木耳的结果略优于麸皮，此时菌丝体鲜质量最大，可以达到31098 6 g100 mL，且考虑到培养基制作过程的简便易行，选择酵母粉作为白背毛木耳液体发酵的主要氮源并进行后续的碳源、氮源正交试验。

23正交试验分析

正交试验中共有9个处理，由表4可知，白背毛木耳液体培养中的4个因素对菌丝体鲜质量的影响表现为B>D>A>C，即酵母粉>KH2PO4>葡萄糖>MgSO4·7H2O。从正交试验直观分析结果可知，各因素水平的最优理论组合为A1B3C1D2，即10%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4，此时菌丝体鲜质量最大。而试验处理最优结果却是A2B3C1D2，即20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4，因此须要做验证试验。

由表5可知，在A2B3C1D2组合条件下白背毛木耳的菌丝体鲜质量达43631 0 g100 mL，略优于A1B3C1D2组合。因此，确定白背毛木耳最佳液体培养基配方组合为A2B3C1D2，即20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4。

24培养温度对白背毛木耳液体菌丝体培养的影响

CM（24]由图1可知，温度过高或过低均会影响白背毛木耳的生长，19～25 ℃时，随温度不断升高菌丝体鲜质量逐渐增加，当发酵温度为25 ℃时，菌丝体鲜质量达到最大值，为 42579 8 g100 mL，高于25 ℃时菌丝体鲜质量略有下降。因此，白背毛木耳液体发酵温度为25 ℃时较为适宜。

25搖床转速对白背毛木耳液体菌丝体培养的影响

由图2可知，转速过高或过低均会影响白背毛木耳的生长，随着转速的不断增加，培养基中溶氧量逐渐增大，当摇床转速为180 rmin时，菌丝体鲜质量达到最大值，为 43200 7 g100 mL。因此，白背毛木耳液体发酵的摇床转速以180 rmin较为适宜。

26装液量对白背毛木耳液体菌丝体培养的影响

液体发酵过程中，装液量也可以直接影响培养基中的溶氧情况。由图3可知，当250 mL的三角瓶中装液量为 100 mL 时，培养结束后菌丝体鲜质量达到最大值，为 43491 3 g100 mL。因此，在进行白背毛木耳液体发酵时，装液量以100 mL（250 mL三角瓶）较为适宜。

FK（W10]TPLM11tif]

27发酵终点试验结果

由图4可知，白背毛木耳在整个液体发酵过程中，发酵液的pH值变化并不大，在54～67之间，总体趋势是先上升后下降，培养3 d时达到最大值，为67，培养4～5 d达到稳定，均为65，而后开始下降。生物量方面，发酵开始后的前 4 d，随着发酵时间的延长，菌丝体鲜质量呈快速增长趋势，此时处于对数生长期，4 d后开始菌丝体生物量增长速度变缓，几乎趋于稳定，6 d后开始有所下降。由表6可知，菌龄为4、5 d的液体菌种在斜面培养基上的萌发时间最短。综合考虑菌丝体生物量、回接试管后菌丝萌发时间和成本因素，确定白背毛木耳液体菌种的发酵终点为 4 d。endprint

28液体菌种的应用

由表7结果可知，白背毛木耳液体菌种接入栽培培养基，其菌丝生长速度比固体菌种快，满袋时间较短，比固体菌种满袋的时间少了9 d，可明显缩短生产周期；耳片的颜色均呈现为CM（25]暗褐色，液体菌种的出耳生物学效率略高于固体菌种。不同菌种应用于栽培后的子實体情况如图5所示。另外，在试验过程中发现采用液体菌种污染率较低，主要是因为液体菌种接种后的萌发点较多，菌丝生长速度快于固体菌种，因此，白背毛木耳的液体菌种可用于生产实践。

3结论

通过碳源、氮源的单因素试验和正交试验，最终确定了白背毛木耳适宜的液体培养基配方为200%马铃薯、20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4。本试验还从起始培养温度、 摇床转速以及装液量3个方面对白背毛木耳的液体培养条件进行了单因素试验，结果表明，白背毛木耳液体培养适宜的条件：培养温度为25 ℃、摇床转速为180 rmin、CM（213]装液量为100KG3]mL（250KG3]mL三角瓶）、发酵终点为4 d。JP3]白背毛木耳液体菌种的发酵速度明显快于固体菌种，满袋时间较短，从而降低了生产成本，生物学效率也略优于固体菌种，且操作简便，具有一定的现实应用优势，可用于生产实践。

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