猕猴桃溃疡病P—L菌株诱导植株系统的抗性

任平　阮祥稳　赵文娟　秦涛

摘要：将不同致病力的猕猴桃溃疡病病菌接种于猕猴桃植株上，测定与抗病性相关的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）这5种防御酶的活性，结果表明，猕猴桃溃疡病不同致病力菌株会导致猕猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明显提高；接种强致病力菌株P-H使猕猴桃植株的5种防御酶活性变化剧烈，尤其是POD活性明显上升后又明显下降；与接种无菌水相比，接种不同浓度P-L菌株可导致猕猴桃植株POD、PPO、SOD、CAT、PAL的活性明显提高，其中接种浓度为107 CFUmL的P-L菌株发酵液，5种酶活性明显高于其他2个浓度处理，且与P-H菌株接种侵染的各酶活性变化趋势相同。高浓度 P-L菌株发酵液具有更好的激发植株体内防御酶活性的能力，弱致病力猕猴桃溃疡病病菌P-L发酵液能诱导猕猴桃植株产生抗病性。

关键词：猕猴桃；溃疡病；防御酶；诱导抗性；P-L菌株；过氧化物酶；发酵液

中图分类号： S436634文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0109-03

收稿日期：2016-06-17

基金项目：陕西省科学院基础研究项目（编号：2013K-16）。

作者简介：任平（1972—），女，陕西西安人，副研究员，主要从事微生物资源应用开发。E-mail：mysrenping@163com。

生物防治是控制植物病害、减少化学农药污染的有效途径，而诱导抗性又是植物病害生物防治的重要机理之一1]。诱导抗性是通过诱发植物免疫机制来实现的，利用物理、化学或生物因子预先处理植物，使原来的感病反应产生局部的或系统的抗性2]。植物经外界刺激或诱导会引起植物产生一些应急反应，进而引起植株的生理生化指标变化，使植物产生抗性。目前，研究植物诱导抗性机制时，主要是研究一些与抗病相关的酶或物质3]。植物受病原菌侵染或生物因子诱导，植物体内与抗病反应密切相关的防御酶活性会升高，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）等是存在于植物体内与抵抗病原微生物侵染有关的重要酶类4]。

猕猴桃溃疡病是猕猴桃生产过程中的一个重要病害，化学药剂难以有效地防控，即使大量使用农药，也收效甚微，还造成猕猴桃产品和生态环境污染。根据“植物获得性抗性”学说5]，用猕猴桃溃疡病弱致病菌株发酵液进行诱导接种，可刺激猕猴桃植株体内产生对溃疡病的抗体，进而使猕猴桃植株产生对溃疡病的抗性，从而达到不用化学农药、用弱致病菌株防控猕猴桃溃疡病的目的，实现猕猴桃的无污染生产。

前期研究发现，接种猕猴桃溃疡病弱致病菌P-L发酵液能提高猕猴桃植株对强致病菌P-H的抗性。在此基础上，本试验通过将不同浓度P-L菌株发酵液接种到猕猴桃植株上，测定其体内PAL、POD、PPO等酶的活性变化，分析弱致病菌是否会引起植物系统产生抗病性，为揭示其生防机理提供依据。

1材料与方法

11试验材料

强致病菌P-H、弱致病菌P-L，由陕西省科学院酶工程研究所微生物实验室筛选出来；15株试验植株为2年生盆栽猕猴桃实生苗。金氏B培养基（KBA培养基）：蛋白酶解蛋白胨200 g，KH2PO4 15 g，MgSO4·7H2O 15 g，甘油150 mL，加蒸馏水到1 L，pH值为72。培养基121 ℃灭菌20 min。

12试验方法

121菌株悬液的制备及接种将不同致病力P-H菌株、P-L菌株分别接种于KBA培养基中，26 ℃ 160 rmin振荡培养30 h；将P-L菌株发酵液用无菌水分别稀释成105、106、107 CFUmL等3个浓度，采用超声波对细胞进行破碎，超声波输出功率为250 W，工作6 s，间隔5 s，总工作时间66 min；将P-H菌株发酵液用无菌水稀释成106 CFUmL作为对照1（CK1），以无菌水处理作为对照2（CK2）；每处理选取长勢一致、健壮的猕猴桃植株各3株，每株选择3张大小均匀、长势良好的叶片，将菌液及无菌水均匀喷在猕猴桃叶片上进行诱导抗性试验，套上保鲜袋。

122POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性的测定接种前及接种后2、6、10、15、20 d分别采集猕猴桃叶片，测定其POD、PPO、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性。POD提取及活性测定参照张龙翔等的方法6]进行，以 1 g 鲜质量1 min内D470 nm值变化001作为1个酶活性单位（U）。PPO提取及活性测定参照朱广廉等的方法7]进行，以1 g鲜质量1 min内D525 nm值变化001为1个酶活性单位（U）。SOD提取及活性测定参照朱广廉等的方法7]进行，以抑制氮蓝四唑（NBT）还原的50%酶量为1个酶活性单位，以不加酶液而用缓冲液代替酶液的处理为空白对照，酶活性计算公式为：

JZ]N=2×（D560 nm空白-D560 nm处理）D560 nm空白。

CAT提取及活性测定参照李合生的方法8]进行，采用紫外吸收法，以1 g鲜质量1 min内D240 nm减少01的酶量为1个酶活性单位（U）。PAL提取及活性测定参照薛应龙等的方法9]进行，以1 g鲜质量D290 nm值变化001所需酶量为1个酶活性单位（U）。

2结果与分析

21P-L菌株不同浓度发酵液对过氧化物酶（POD）活性的影响

由图1可知，处理组和对照组在接种前的POD活性差异不明显；处理组和CK1的POD活性在接种后2～6 d多为缓慢升高，在接种后6～10 d的POD活性明显上升且达到峰值，后下降较快，接种15 d后趋于平稳；接种后20 d时，处理组和CK1的POD活性仍高于CK2；CK2的POD活性在20 d内变化不大；处理C（P-L菌株发酵液浓度为107 CFUmL）的POD活性明显高于其他2个处理；处理组的POD活性变化趋势与CK1一致，且POD活性始终高于CK2，这是由于当病原菌在植株体内活动时，过氧化物酶对病原菌极为敏感，很可能与其他代谢系统协同作用，使体内活性氧物质保持在一个正常的动态水平，同时，其还可以氧化枝条组织中的酚类化合物，相应产物阻止病原物的扩展，提高了其抗性水平。107 CFUmL 高浓度P-L菌株发酵液具有更强激发POD活性的能力。endprint

22P-L菌株不同浓度发酵液对多酚氧化酶（PPO）活性的影响

由图2可知，处理组和对照组在接种前的PPO活性差异不明显；处理B、处理C、CK1的PPO活性在接种后2～10 d明显上升且达到峰值，后下降较快，接种后20 d仍高于CK2；处理A的PPO活性在接种后2～6 d缓慢升高，在接种后6～10 d的PPO活性明显上升且达到峰值，后有所下降，接种后20 d时，处理A的PPO活性高于处理B、CK2；CK2的PPO活性在20 d内变化不大；处理C的PPO活性明显高于其他2个处理；处理组的PPO活性变化趋势与CK1基本一致，且其PPO活性始终高于CK2，这可能是由于植物在对病原菌侵染的防卫反应中，需要更多的多酚氧化酶参与，而多酚氧化酶不仅参与酚类物质的氧化，同时也参与木质素的形成，木质素一方CM（25]面增加了细胞壁抗病原物的穿透压力，另一方面限制了真菌酶和毒素的扩散，阻碍了病原菌从寄主获得水和营养物质10]。107 CFUmL高浓度P-L菌株发酵液具有更强激发PPO活性的能力。

23P-L菌株不同浓度发酵液对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由图3可知，处理组和对照组在接种前的SOD活性差异不明显；处理组和CK1的SOD活性在接种后2 d呈下降趋势，处理B、处理C、CK1在接种后2～10 d的SOD活性明显上升并达到峰值，后下降较快，接种后20 d时，处理组和CK1的SOD活性仍高于CK2；处理A的SOD酶活性在接种后2～15 d缓慢上升且达到峰值，接种后20 d时的SOD活性高于处理B、CK2；CK2的SOD活性在20 d内变化不大；处理C的SOD酶活性高于其他2个处理；处理组的SOD活性变化趋势与CK1一致，且其SOD活性始终高于CK2，这可能是当病原菌侵染时SOD活性上升，以清除病原菌刺激产生的自由基，防止氧自由基伤害细胞膜系统，使细胞内保持一个稳定、有利于生长的环境11]。107 CFUmL高浓度P-L菌株发酵液具有更强激发SOD活性的能力。

24P-L菌株不同浓度发酵液对过氧化氢酶（CAT）活性的影响

由图4可知，处理组和对照组在接种前的CAT活性差异不明显；处理组和CK1的CAT活性在接种后6 d达到第1个峰值，这可能是在病菌侵染初期，细胞经SOD过程产生H2O2，使胞内活性氧的数量迅速增加，CAT活性也随之上升；后CAT活性值下降，并在接种10 d后又上升，在接种后15 d CAT活性达到第2个峰值，这可能是猕猴桃接种病菌，其枝条细胞有新的代谢产物产生，从而进一步刺激CAT活性上升；处理组的CAT活性变化趋势与CK1一致，且CAT活始值高于CK2。107 CFUmL高浓度P-L菌株发酵液具有更强激发CAT活性的能力。

25P-L菌株不同浓度发酵液对苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响

由图5可知，处理组和对照组在接种前的PAL活性差异不明显；处理组和CK1的PAL活性在接种后2～6 d明显升高，接种后6 d PAL活性达到峰值，后又缓慢下降，接种10 d后趋于平稳；接种后20 d时，处理组和CK1的PAL活性仍高于CK2，CK2的PAL活性在20 d内活性变化不大；处理组的PAL活性变化趋势与CK1一致，且PAL活性始终高于CK2，这可能是由于病原菌攻击引起植物体合成大量新的PAL，以抵抗病原菌侵入对植物的伤害。107 CFUmL高浓度P-L菌株发酵液具有更强激发PAL活性的能力。

3结论与讨论

植物病害生物防治机制包括抗生作用、溶菌作用、重寄生作用、竞争作用、交互保护作用及促生作用12-13]，诱导系统抗性也被认为是生防菌的一种重要防病机制。植物的诱导抗病包括木质化、防御酶活性、病程相關蛋白、植保素等多种生理生化因子的合成。有大量研究表明，参与植物体内多种防卫反应的PAL、PPO、POD等酶系与植物抗病性密切相关14]，这些酶的活性与植株抗病性呈正相关，在植物的抗病反应中起到非常重要的作用。

接种猕猴桃溃疡病不同致病力菌株会导致猕猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明显提高，而接种强致病力菌株会使猕猴桃的5种防御酶活性变化剧烈，尤其是POD活性急剧上升后又迅速下降，这种变化可能与强致病力菌株对植物具有致病性，能导致植物发病及生理功能紊乱等有关15]；与接种无菌水相比，接种P-L菌株不同浓度发酵液可导致猕猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明显提高，其中接种浓度为107 CFUmL P-L菌株发酵液的猕猴桃植株的5种酶活性明显高于接种106、105 CFUmL的，且与P-H菌株侵染后的酶活性变化趋势相同，107 CFUmL高浓度P-L菌株发酵液具有更强激发植株体内防御酶活性的能力。

不论是弱致病菌还是强致病菌，在一定程度上都可导致与抗病反应相关的一些生理生化指标的变化，而且有时植株对强致病力溃疡病菌的反应更加敏感。因此，在诱导植物提高抗病能力时，须选择合适的诱导菌株和接种强度，以达到预期的生防目的。

HS223]参考文献：

1]ZK（#]谭可菲，段玉玺，朱晓峰，等 根结线虫生防菌snef8对番茄诱导抗性的初步研究J] 黑龙江农业科学，2011（1）：22-24

2]令利军，冯蕾，雷蕾，等 地衣芽孢杆菌TG116诱导黄瓜抗病性相关防御酶系的研究J] 西北师范大学学报（自然科学版），2016，52（1）：100-104

3]张鹏翀，胡增辉，沈应柏 植物诱导抗性的研究进展J] 现代农业科学，2008，15（9）：22-23

4]Zheng Y H，Fung R M，Wang S Y，et al Transcript levels of antioxidative genes and oxygen radical scavenging enzyme activities in chilled zucchini squash in response to super atmospheric oxygenJ] Postharvest Biology and Technology，2008，47（3）：151-158

5]刘永胜，王永，秦立金，等 FOC-RA-5诱导后黄瓜叶片内几种酶活性的变化J] 北方园艺，2016（6）：1-5

6]张龙翔，张庭芳，李令媛 生化实验方法和技术M] 2版北京：高等教育出版社，1997

7]朱广廉，钟海文，张海琴 植物生理学实验M] 北京：北京大学出版社，1990

8]李合生 植物生理生化试验原理和技术M] 北京：高等教育出版社，2000：32-33

9]薛应龙，欧阳光察，澳绍根 植物苯丙氨酸解氨酶的研究Ⅳ水稻幼苗中PAL活性的动态变化J] 植物生理学报，1983，9（3）：301-305

10]ZK（#]张树生，胡蕾，刘忠良，等 植物体内抗病相关酶与植物抗病性的关系J] 安徽农学通报，2006，12（13）：48-49，5

11]李淼，檀根甲，李瑶，等 不同抗性猕猴桃品种感染溃疡病前后几种保护酶活性变化J] 激光生物学报，2009，18（3）：370-378

12]陈立华，金秋，牛明，等 棘孢木霉对水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌生物防治的研究J] 江苏农业科学，2015，43（5）：115-117

13]李建文，高易宏，吴辉，等 生防菌BS04防治辣椒疫病机制J] 江苏农业科学，2015，43（10）：151-153

14]林陈强，李占飞，张慧，等 枯草芽抱杆菌CS16诱导香蕉抗病性相关防御酶系的研究J] 福建农业学报，2013，28（6）：570

15]张赛群，邹燕红，吴素琴，等 青枯雷尔氏菌无致病力菌株诱导番茄系统获得性抗性研究J] 厦门大学学报（自然科学版），2008，47（增刊2）：31-35endprint