春兰杂交种子无菌萌发及植株再生培养技术

马辉　张甜　梁丽君　包建忠　陈秀兰　孙叶

摘要：研究了春兰种内杂交种和种间杂交种的结实情况，种子无菌萌发和植株再生培养技术。结果发现，春兰种内杂交、春兰与蕙兰种间正反交结果率和种子量都比较正常，春兰种内杂交种萌发率明显高于种间杂交种；春兰种内杂交种第1年杂交种子萌发数大于50的占到1111%，第2年杂交种子萌发数大于50组合为24%，第3年杂交种子萌发数大于50的占到3827%，春兰品种自交种、种子萌发原球茎出现不同程度的白化变异；春兰和大花蕙兰种间正反交结果率差异较大，蒴果种子量少，但种子萌发数多，种子培养第1年萌发数均大于100；春兰种内杂交种子萌发后根状茎增殖和芽诱导液体培养方式的增殖生长量和形成优势数明显优于固体培养。在“环球荷鼎×九章梅”杂交种组培小苗根诱导试验中，当活性炭浓度为1 gL，NAA浓度为05 mgL时，组培苗平均新根数和平均新根长数最大。

关键词：春兰；人工杂交；无菌萌发；植株再生

中图分类号： S6823104+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0049-03[

[HJ14mm]

收稿日期：2016-05-26

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（13）5071）。

作者简介：马辉（1987—），男，江苏泰州人，研究实习员，主要从事花卉组织培养研究。E-mail：mhhao520@qqcom。

通信作者：孙叶，硕士，副研究员，主要从事花卉育种和组织培养研究。E-mail：sunye9999@126com。

春兰（Cymbidium goeringii）是兰科兰属地生兰类多年生草本，是传统中国兰的代表种，原产于我国长江流域或西南地区，日本和朝鲜半岛也有分布。春兰名优品种具有很高的观赏价值和经济价值，在东南亚特别是日本、韩国和台湾地区十分受欢迎。春兰的花期恰逢农历春节，在年宵花市场有很大的开发潜力。利用春兰名优品种作为亲本，进行种内杂交和种间杂交，是丰富春兰花期、花型、花色性状，选育春兰优良新种质的有效途径，人工杂交育种和组培快繁技術对春兰产业的发展有十分重要的意义。

1材料与方法

11材料

试验材料春兰、蕙兰（C faberi）、大花蕙兰（C hybrids）由江苏里下河地区农业科学研究所“香兰苑”中国兰种质资源圃提供；无菌播种材料为2009年以来人工杂交获得的杂交种；增殖培养和芽分化材料为杂交种2012年无菌萌发后形成的原球茎或根状茎；根诱导试验材料为“环球荷鼎×九章梅”杂交组合杂交种经无菌萌发，增殖培养和芽诱导培养后的 3～4 cm 无根组培苗。

12方法

121人工杂交2009—2015年春，对花期相遇的春兰、蕙兰、大花蕙兰作为亲本进行人工授粉杂交。杂交组合主要分为春兰种内品种间杂交、春兰与蕙兰的种间杂交、春兰与大花蕙兰的种间杂交。授粉时用干净的镊子把母本的花粉取下，将父本的花粉块放入母本的蕊腔中，用记号笔在花盆上和试验记录本上写明杂交组合名称、杂交时间，3个月后登记结果率；分别在无菌播种后12、24、36个月统计杂交种萌发率。

122种子无菌播种及萌发时间统计采收成熟度为5—7个月、果皮略黄但尚未裂开的蒴果，种子前处理后，播于固体培养基，每个塑果播10瓶，统计相对种子量。培养基配方为12MS+05 mgLNAA+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL 活性炭+70 gL琼脂，pH值51～54。播种后暗培养，室温为25～28 ℃，种子萌发后见光培养10～12 hd，3个月后每月统计杂交组合的杂交种子萌发数。

123增殖培养、芽分化诱导的基本培养增殖培养、芽分化诱导的基本培养基为12MS+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL活性炭，pH值51～54，固体培养基加7 gL琼脂粉，液体培养基不添加琼脂粉。3因素随机区组试验，A因素为不同杂交组合，5个材料；B因素为NAA和6-BA浓度配比，5个水平；C因素为培养方式，液体培养或固体培养。每个处理培养4 g根状茎，10个重复，培养3个月后称质量统计，统计根状生长量和优势芽数。

124生根诱导的基本培养生根诱导的基本培养基基本培养基为12MS+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL马铃薯粉，pH值51～54。2因素试验，A因素为活性炭浓度，3个水平，B因素为NAA浓度，3个水平。每个处理接种6株无根小苗，5个重复，培养90 d后测量和统计每处理的平均新根数和平均新根长。

2结果与分析

21春兰人工杂交的结果率及杂交组合萌发情况

研究发现，春兰种内及春兰、蕙兰种间杂交的结果率和种子量都很正常。春兰种内杂交的组合萌发率为525%，较春兰种间杂交高；大花蕙兰作为母本和春兰杂交不容易获得蒴果，种子发育不正常，没有萌发的组合；春兰作为母本与大花蕙兰杂交结果率达80%，但种子量较正常杂交种少，但由于兰花杂交种子总量大，春兰和大花蕙兰杂交种种子萌发后群体仍然很大，并不影响种苗快繁和新品种选育（表1）。

22春兰品种间杂交种的种子萌发情况

春兰和蕙兰种间杂交部分杂交种能正常萌发，但种子萌发时间较长，种子萌发数较低，均小于50（表2）。春兰和大花蕙兰杂交，杂交组合第1年就能大量萌发，第2年少量萌发，第3年基本已不萌发（表3）。

春兰种内杂交种子第1年萌发数大于50的组合占到1111%，第2年杂交种子萌发数大于50组合为24%，第3年杂交种子萌发数大于50的组合占到3827%。其中第1年[CM（25]萌发数较大的组合以种子萌发大于100为主，第2、第3年

萌发数较大的组合以种子萌发大于50为主。所有萌发组合中，种子萌发量较大的组合占到5178%（表4）。endprint

春兰自交种子3年内种子萌发数较大的组合占 6364%，但自交种萌发后出现原球茎白化现象的组合占 7273%，白化率最高达到364%。这些白化材料能正常增殖和芽分化，培养出白化苗，但组培苗成苗率较低，绿色材料能正常培养，组培苗出瓶后生长性状也比较稳定（表5）。

23春兰品种间杂交种的增殖培养和芽分化诱导

不同杂交组合的杂交种根状茎在NAA浓度为05 mgL的液体培养基增殖培养生长量较大，与固体培养基比较，液体培养基中培养根状茎增殖生长量大；根状茎在NAA、6-BA浓度为（0+2） mgL和（1+3） mgL时，优势芽较多，同一激素浓度下，液体培养基较固体培养基平均优势芽多；不同杂交组合的根状茎生长和芽诱导的最佳培养基配方和最佳培养方

式不同（表6）。

24春兰品种间杂交种的根诱导

当活性炭浓度为10 gL、NAA浓度为05 mgL时，组培苗平均新根数和平均新根长最大。NAA浓度相同时，随着活性炭浓度增加平均新根數增加，但无显著影响，活性炭浓度相同时，随着NAA的浓度增加平均新根数和平均新根长增加，且影响显著（表7）。

3结论与讨论

春兰的品种创新水平严重落后于国外兰科花卉，主要原因是人工杂交选育还未成为中国兰品种创新的主要途径。兰科植物人工杂交选育新品种的主要技术瓶颈为杂交种子的无菌萌发和植株再生培养[1-4]，本研究结果表明，春兰品种间杂交种结果率很高，杂交组合萌发率达525%，种子萌发时间长达3年左右，1年内萌发，种子萌发数大的杂交种仅占58%，这与以往的研究结果[5]一致。春兰杂交种的萌发特点增加了人工杂交育种的难度，因此增加杂交组合的数量，延长杂交种子的萌发时间是提高杂交种萌发率的有效途径。

春兰、蕙兰都属于兰属地生兰种，亲缘关系较近，大花蕙兰是通过兰属中的大花附生种、小花垂生种以及一些地生兰经过多代人工杂交育成的品种群。本研究发现春兰种间杂交组合中，春兰和蕙兰正反交结果率都正常，但杂交种萌发率低，种子萌发时间长，种子培养2～3年后才萌发，且种子萌发数也较少，均未超过50个。春兰和大花蕙兰的正反交杂交种的结果率差异明显，春兰为母本时能得到杂交蒴果，但杂交种种子量较正常杂交种少，杂交种萌发时间短，以种子→原球茎→完整植株途径生长发育成苗，这是附生兰种子发育的特点。以往研究结果也发现具有附生兰血统的大花蕙兰与地生兰杂交具有此特点[6-10]，因此推测，春兰、蕙兰杂交种的种子萌发困难、萌发时间长是由地生兰的特性决定的，研究相关内容可

能是解决中国兰杂交种萌发困难、萌发时间长问题的关键。

春兰的组培快繁是实现规模化生产的重要前提，植物组培用培养基有固体培养基和液体培养基，液体培养基相对固体培养基组织培养量大，可培养时间长，工序简单，节省成本，本研究结果证明液体培养基增殖培养和诱芽培养效果优于固体培养基，与已有研究报道[11-13]一致，但还未受到广泛关注，液体培养方式对于春兰大规模组培快繁有很高的应用价值，可尝试推广。

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