萝卜花序轴再生体系的建立

娄丽娜　戴澈　刘根新　乔俊楠　季延娣　苏小俊

摘要：以萝卜雄性不育系的幼嫩花序轴为外植体进行组织培养，可成功诱导出苗。将幼嫩花序轴接种到不同激素配比的愈伤组织诱导培养基上，其中在MS+6-BA 30 mgL+NAA 06 mgL培养基培养效果最好，诱导率高达9231%；用MS+6-BA 10 mgL+NAA 01 mgL培养基诱导成苗，获得1株再生苗，成苗率为333%；用MS+NAA 10 mgL培养基成功对幼嫩花序轴进行生根培养，并被驯化移栽成活。

关键词：萝卜；花序轴；组织培养；雄性不育系；激素；外植体；诱导率；成苗率；驯化

中图分类号： S631104+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）21-0042-02[

收稿日期：2016-09-20

基金项目：江苏省自然科学基金青年基金（编号：BK20130726）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（16）1012]。

作者简介：娄丽娜（1982—），女，河南濮阳人，博士，副研究员，主要从事蔬菜作物遗传育种研究。Tel：（025）84391221；E-mail：linabeibei@163com。

通信作者：苏小俊，博士，研究员，主要从事蔬菜作物遗传育种研究。Tel：（025）84391259；E-mail：xiaojunsu@yahoocom。

萝卜为异花授粉植物，在萝卜杂交育种中，自交不亲和及雄性不育性状，是杂交制种的2个重要应用。研究人员选出的不育系不能立即应用于配制杂种，对这样的材料，采用组织培养的方式进行保存和繁殖就成为必要手段之一。1980年，祝仲纯等成功从萝卜的下胚轴中诱导植株[1]。随后，国内外学者采用萝卜的外植体如带柄子叶、子叶、下胚轴、带芽茎段以及顶芽等进行培养，均取得了一定的成果[2-8]。

然而，与大多数植物相比，萝卜的再生能力较弱，不易通过愈伤组织途径形成再生植株[9]。在萝卜中，通常是通过种子萌发获得无菌外植体，直接诱导产生不定芽，再分化成完整的植株。在实际的生产实践中，当发现某个材料是雄性不育材料时，往往已经是生殖生长期，无法通过种子途径对材料进行保存，也无法通过其营养体阶段的顶芽进行组织培养保存，根据吴丽艳等的研究，采用花序轴组培快繁青花菜萝卜胞质雄性不育系，获得了成功[10]，但在萝卜上能否成功，鲜见报道。本试验利用萝卜雄性不育材料的花序轴为外植体，系统研究其诱导、分化、生根和移栽等步骤，从而建立一套萝卜花序轴组培快繁的技术体系，为萝卜育种材料的保存、繁殖提供参考，为特殊材料的研究和利用奠定基础。

1材料与方法

11材料

江苏省农业科学院蔬菜研究所提供的萝卜雄性不育材料R3-654。

12培养基与培养条件

本试验所用的诱导培养基、不定芽分化培养基以及生根培养基都是在MS基本培养基的基础上，添加植物激素组成的，具体配比如表1所示。培养基的蔗糖浓度均是 20 gL，并添加琼脂07%，pH值为58。接种后置于 25 ℃ 下，光照度为2 500 lx，光照时间为12 hd。

13试验方法

131外植体消毒处理

从供试材料植株上取幼嫩花序轴，用洗涤剂洗涤后，自来水流动冲洗30 min，用70%乙醇浸泡40 s，再放入10%次氯酸钠中消毒5～10 min，在超净工作台上用无菌水冲洗3～4次，最后一次浸泡3～5 min，用无菌滤纸吸干表面水分，将花序轴切成05～10 cm的小段待用[11]。

132诱导培养

经处理后的花序轴小段分别接种到（1）、（2）、（3）、（4）、（5）号培养基上，10 d后观察愈伤组织情况，计算愈伤组织诱导率（%）。

133分化培养

将愈伤组织转接到（6）、（7）、（8）、（9）号增殖培养基中继续培养，30 d后统计出苗数，计算成苗率（%）。

134组培苗的生根和移栽

[JP2]通过继代增殖形成的无根苗长成3～4 cm高并带有2～3张幼叶时，转入（10）号生根培养基上培养诱导生根[5]。20～25 d后，将试管苗的瓶盖打开放到温室内过渡2～3 d，取出试管苗，洗净根部附着的培养基，栽入到已灭菌的营养土中，放入拱棚后在上面覆盖塑料膜和遮阳网，每天揭膜若干小时，保持一定的温度（20～28 ℃）和湿度（85%～90%），10 d后移栽到大田，20 d后考察成活情况。

2结果与分析

21不同激素配比培养基对愈伤组织的诱导效果

在诱导培养基上培养10 d后发现，在（1）、（2）、（3）、（4）号诱导培养基中的花序轴小段的切口部位逐渐膨大，并产生淡绿色的愈伤组织。由图1-A、图1-B可知，（1）、（2）号培养基中的愈伤组织与其他组织相比，愈伤组织较大且较多的外植體都产生了淡绿色的愈伤组织。诱导培养基（3）诱导效果较差，只有少数的外植体膨大，多数外植体发生了褐变和白化现象（图1-C）；（4）号培养基的诱导效果一般，只有部分外植体膨大，产生绿色愈伤组织，部分外植体也出现了褐变现象（图1-D）；作为对照的（5）号诱导培养基，未添加激素，其外植体膨大较少，零星几个膨大，且愈伤组织较小（图1-E）。

不同激素配比对愈伤组织的诱导率不同。由表2可知，（1）、（2）号培养基的诱导率较高，分别为9000%、9231%；其次为（4）号培养基，诱导率为4545%；（3）号诱导培养基较差，诱导率仅为1667%；作为对照的（5）号培养基最差，诱导率仅为727%。

22不同激素配比培养基对成苗的诱导效果及生根培养

将诱导出的愈伤组织分别接种到（6）、（7）、（8）、（9）号培养基上继续培养，7 d后（7）号培养基上即开始出现绿色的芽点，并逐渐分化成小芽，逐渐发育为小植株（图2-A）。有的在愈伤组织上，开始有绿色的组织生成，但直到30 d后，也未诱导成芽，进而也未发育成苗（图2-B）。endprint

采用（10）号生根培养基对获得的无根苗进行生根诱导，产生了十几条根，较粗壮且平整（图2-C）。证明武剑等采用的萝卜生根方法，可以有效地应用在本试验中[5]。经过驯化和移栽，最终成功获得R3-654的再生植株。

由表3可看出，最终只在（7）号培养基上，获得1个植株，成苗率为333%。

3讨论

在诱导愈伤组织的培养基上，（1）、（2）号培养基的6-BA的浓度均为 30 mgL，而浓度为06 mgL NAA比浓度为04 mgL的诱导率稍高，但二者的诱导率相差不大，且诱导效果较好；对比（3）、（4）号培养基，6-BA浓度相同，均为40 mgL，NAA的浓度分别为04、06 mgL，但诱导率较（1）、（2）号培养基低，同样NAA的浓度为 06 mgL 比 04 mgL 的诱导率稍高。说明6-BA浓度为 30 mgL，NAA浓度为06 mgL的诱导培养基诱导愈伤组织效果最好，诱导率高达9231%。

设置4个分化培养基，但只在（7）号培养基上获得1株再生苗，说明萝卜的再生能力较弱，不易通过愈伤组织途径形成再生植株，这与熊秋芳等的结论[9]一致。本试验的诱导成苗率太低，须要对分化培养基的激素种类和配比进行进一步的探索，同时在试验中要降低污染率、提高成苗效率。

采用了武剑等的方法[5]对再生植株进行生根、驯化及移栽，获得萝卜R3-654的再生植株，证明MS+NAA 10 mgL 对萝卜无根苗的生根的效果很好，在苗数较少的情况下，可以保证再生苗的成活率。

本研究结果表明，虽然萝卜的再生能力较弱，通过愈伤组织途径形成再生植株较困难，但采用花序轴作为外植体对萝卜雄性不育株进行诱导愈伤组织，再生植株的方法是可行的。如果后续研究能提高愈伤组织再生苗的成活率，那么该方法就[CM（25]可被广泛应用于萝卜雄性不育系的种质保存和杂交育种

中，具有很好的理论研究和实际应用价值。

参考文献：

[1][ZK（#]祝仲纯，吴海珊 从萝卜的下胚轴诱导植株成功[J] 遗传，1980，2（3）：36

[2]崔群香，汪隆植，娄平，等 从萝卜下胚轴再生完整植株[J] 南京农专学报，1999，15（4）：29-36

[3]Jeong W J，Min S R，Liu J RSomatic embryogenesis and plant regeneration in tissue culture of radish （Raphanus sativus L）[J] Plant Cell Reports，1995，14（10）：648-651

[4]Pua E C，Sim G E，Chi G L，et al Synergistic effect of ethylene inhibitors and putrescine on shoot regeneration from hypocotyl explants of Chinese radish （Raphanus sativus L var longipinnatus Bailey） in vitro[J] Plant Cell Reports，1996，15（9）：685-690

[5]武劍，龚义勤，邓波，等 萝卜雄性不育组织培养的研究[J] 贵州农业科学，2003，31（5）：8-11

[6]武剑，龚义勤，邓波，等 萝卜离体再生的影响因素[J] 中国蔬菜，2003（6）：6-8

[7]李海萍，张鲁刚，张静，等 萝卜带柄子叶高频再生体系的建立[J] 植物学报，2011，46（3）：331-337

[8]毛倩卓 侵染萝卜的dsRNA病毒研究——带病毒萝卜的组织培养、细胞和分子生物学研究[D] 杭州：浙江理工大学，2011：12-15

[9]熊秋芳，张雪清，骆海波，等 萝卜组织培养的研究与应用[J] 长江蔬菜，2006（5）：36-38

[10][ZK（#]吴丽艳，柏柯帆，李石开，等 利用花序轴组培快繁青花菜萝卜胞质雄性不育系的研究[J] 云南农业大学学报（自然科学版），2009，24（5）：712-716

[11]赖正锋，林加耕，李华东，等 日本高秆青花菜组织培养初探（简报）[J] 亚热带植物科学，2005，34（1）：64endprint