拟南芥热激因子AtHsfA1a在低温胁迫下对细胞程序性死亡中Caspase—3活性的影响

郭丽红　徐娅　郤秋霞　李念　檀文涛　张学兰

摘要：为了研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对低温胁迫下细胞程序性死亡（programmed cell death，简称PCD）中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific protease，簡称Caspase）活性的影响，进一步确定拟南芥热激因子AtHsfA1a与低温胁迫中PCD的关系。以热激因子AtHsfA1a不同基因型（野生型、基因沉默型）的拟南芥为材料，首先获得单细胞，于4 ℃处理1 h后，测定热激因子AtHsfA1a的表达量，发现基因沉默型中AtHsfA1a的表达量低于野生型。接着用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，简称DAPI）进行染色，在荧光显微镜下观察细胞形态，结果表明，低温胁迫后野生型未出现凋亡小体，基因沉默型的细胞出现了细胞凋亡小体。最后根据荧光底物Ac-DEVD-pNA的断裂程度测定Caspase-3活性，结果发现，低温处理后的拟南芥Caspase-3活性明显增强，而]AtHsfA1a基因沉默型拟南芥Caspase-3活性比野生型拟南芥的高，说明低温胁迫下拟南芥AtHsfA1a能够抑制Caspase-3蛋白酶的活性。研究结果初步表明，在低温胁迫下拟南芥热激因子AtHsfA1a可以通过抑制 Caspase-3 蛋白酶的活性而对细胞程序性死亡有一定的抑制作用，这对于揭示植物耐逆境反应机制具有重要意义。

关键词：拟南芥；热激因子AtHsfA1a；低温胁迫；细胞程序性死亡；Caspase-3活性

中图分类号： Q94578文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）21-0024-03[HS）][HT9SS]

收稿日期：2016-06-02

基金项目：国家自然科学基金（编号：31260061、31060039）；云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室项目（编号：GXZD201601）。

作者简介：郭丽红（1971—），女，云南大理人，博士，教授，主要从事植物生理学与分子生物学研究。E-mail：guolihong7122@163com。

在自然界中，低温是影响植物生长发育、制约农作物增产增收的主要因子。植物细胞在遭受各种低温胁迫时，转录因子调控一系列防御基因的表达，启动相应的耐低温生理、生化途径，从而获得耐低温能力。植物热激因子（heat shock transcription factor，简称HSF）是真核生物中结构和功能上相对保守的一类转录因子家族，多个HSFs家族成员形成了复杂的分子网络[1-2]。根据寡聚域的区别，HSF可分为A、B、C三类，A类HSF（HsfA）主要负责基因表达的调控[3-4]。拟南芥中存在21个HSFs，研究表明，AtHsfA1a是HsfA类中参与逆境调控的重要转录因子[5-7]。研究发现，逆境胁迫可以诱导植物细胞程序性死亡（programmed cell death，简称PCD），PCD是一个由基因决定的自动结束生命的过程，表现出特殊的细胞形态特征，具有复杂的生化基础[8-10]。关于HSF对PCD的调控，在动物中获得了一些有价值的研究成果，研究发现哺乳动物HSF1诱导热激蛋白的表达可以保护细胞免受胁迫引起的细胞凋亡[11]，HSF1可以调控干细胞中与PCD相关基因FasL的表达[12]，也可以调控肠癌细胞的抗细胞凋亡基因[WTBX][STBX]BAG3和XAF-1的表达[13-14]。但是对于植物中HSF与PCD的直接关系研究相对较少，尚不清楚热激因子AtHsfA1a是否调控PCD以及如何调控PCD。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，简称Caspase）家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3是凋亡信号通路中一个重要的蛋白酶，也是凋亡的关键执行分子[15-16]。关于Caspase-3能否在AtHsfA1a调控PCD的过程中起作用值得研究。为了研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对低温胁迫下细胞程序性死亡中Caspase-3的影响，以热激因子AtHsfA1a不同基因型（野生型、基因沉默型）的拟南芥为试验材料，在低温处理后，测定热激因子AtHsfA1a的表达量并观察细胞形态，分析拟南芥热激因子AtHsfA1a对低温胁迫下Caspase-3活性的影响。本试验旨在鉴定拟南芥热激因子AtHsfA1a与低温胁迫下PCD的关系，对于揭示热激因子AtHsfA1a的作用机制和PCD的调控机制均具有重要的意义。

1材料与方法

11材料

拟南芥哥伦比亚种（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia）；]AtHsfA1a基因沉默的转基因拟南芥植株（ST）、野生型拟南芥植株（WT），由云南省高校特色生物资源开发与利用重点实验室提供。

12方法

121拟南芥]AtHsfA1a不同基因型单细胞获得及低温处理用01%HgCl2和70%乙醇对拟南芥种子进行灭菌处理后，将种子接种于MS固体培养基中，置于25 ℃光照下萌发。待种子长出3或4张真叶时，将小苗移至土壤中，用保鲜膜遮盖，遮阴恒温培养3 d后去膜，4周后取不同基因型拟南芥叶片，用无菌水冲洗干净后依次用75%乙醇、01% HgCl2灭菌。将灭菌的拟南芥叶片切成边长为05 mm的正方形叶片，将叶片置于愈伤组织诱导培养基（MS培养基中添加 3 mgL 2，4-D、03 mgL 6-BA）上，置于25 ℃温度条件下光照培养（16 000 lx），诱导愈伤组织。将疏松透明的愈伤组织放入液体培养基（以MS培养基为基本培养基，添加3 mgL 2，4-D、03 mgL 6-BA）中。在120～140 rmin、（25±05） ℃的摇床中进行振荡悬浮培养，每周更换新鲜液体培养基2次，每次更换13体积，直至获得分散的单个悬浮细胞。将单细胞培养液置于4 ℃低温处理1 h，以25 ℃为对照温度。endprint

122拟南芥]AtHsfA1a不同基因型细胞低温处理后AtHsfA1a表达量的测定参照Guo等的方法[17]。总RNA提取采用QIAGEN RNA提取试剂盒，采用15%琼脂糖凝胶电泳（120 V）15 min，在凝胶成像仪下检测总RNA。按照下列配方反转录合成cDNA：RNAmRNA（8 μL）、Transcript TmRTRI Enzyme Mix（1 μL）、Anehored Oligo（dT）18（1 μL）、2×TS Reaction Mix（10 μL），加RNase-free water 定容至 20 μL，轻轻混匀后，在85 ℃水浴锅中加热5 min以失活Trans ScriptTMRT。以反转录产物作为PCR模板，[WTBX][STBX]Actin2作为内参，扩增引物如下：[WTBX][STBX]AtHsfA1a-F，5′-AATGGGCTTGGAGAG [JP3]ATGAAT-3′，[WTBX][STBX]AtHsfA1a-R，5′-AATGCCGAGACTTCCCAGAT-3′；[WTBX][STBX]Actin2-F，5′-TTGTCACACACAAGTGCATCAT-3′，[WTBX][STBX]Actin2-R，5′-AAGCTGGGGTTTTATGAATGG-3′。PCR扩[JP3]增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增后的产物用15%琼脂糖凝胶电泳检测。

123拟南芥]AtHsfA1a不同基因型细胞程序性死亡的形态特征观察取于4 ℃处理1 h的2种类型拟南芥单细胞，涂在载玻片上，用01%多聚甲醛固定30 min，再用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，简称PBS）洗5 min。将制备好的装片用5 mgL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，简称DAPI）染液染色10 min，用盖玻片封片，避光将制作好的装片放到载物台上，用荧光正置显微镜在359 nm激发光下观察细胞的形态学变化。

124拟南芥]AtHsfA1a不同基因型细胞中Caspase-3活性的检测将细胞在液氮中研磨后，悬浮在裂解液[含 50 mmolL pH值80的Tris-HCl，15 mmolL NaCl，1%Triton X-100，01 mgL苯甲基磺酰氟（PMSF）]中，在冰上轻轻摇动培养30 min后，于4 ℃、12 000 g离心5 min，取上清液备用。蛋白浓度测定采用Bradford的方法[18]。Caspase-3的活性通过测定荧光底物Ac-DEVD-pNA的断裂程度来衡量[以单位时间、单位质量蛋白的对硝基苯胺（p-nitroaniline，简称pNA）的数量表示]，在405 nm处测定自由荧光pNA的吸光度[19]。

2结果与分析

21拟南芥AtHsfA1a不同基因型细胞中低温胁迫后[WTBX][STBX]AtHsfA1a的表达情况[HT]

以]AtHsfA1a基因沉默的转基因植株和野生型植株为试验材料，拟南芥]AtHsfA1a基因沉默植株是本试验前期通过RNA干扰技术获得内源]AtHsfA1a基因沉默的转基因拟南芥植株。由于RNA干扰，该植株]AtHsfA1a基因不能正常表达。为了探究拟南芥热激因子AtHsfA1a对低温胁迫下细胞程序性死亡中Caspase-3活性的影响，首先必须研究在低温环境下]AtHsfA1a基因沉默的转基因植株和野生型中]AtHsfA1a基因的表达情况。将2种基因型细胞在4 ℃低温处理1 h，以 25 ℃ 為对照温度，然后提取总RNA，逆转录获得cDNA，再用[WTBX][STBX]AtHsfA1a引物进行PCR扩增。由图1可以看出，在25 ℃下野生型的AtHsfA1a条带比基因沉默型的亮；在4 ℃下，2种基因型的AtHsfA1a条带亮度明显增强，但野生型的AtHsfA1a条带也明显比基因沉默型的亮，说明基因沉默型的热激因子的AtHsfA1a由于RNA干扰无法正常表达。以Actin2为对照，计算相对表达量，从图2中可以看出，在同一温度下，野生型中AtHsfA1a的表达量高于基因沉默型，经过低温胁迫处理后的野生型中的表达量增量较多，而基因沉默型中的表达量虽有所增加，但增加量相对较少。

22拟南芥AtHsfA1a不同基因型细胞中低温胁迫后细胞程序性死亡的形态特征[HT]

将热激因子AtHsfA1a不同基因型的细胞置于4 ℃低温处理1 h后，通过DAPI染色后封片，在荧光显微镜下观察。从图3中可以看出，野生型拟南芥的单细胞在低温胁迫下，细胞核开始发生变化，但未出现凋亡小体，基因沉默型的细胞出现了细胞凋亡小体，细胞质的浓缩现象更突出。细胞程序性死亡凋亡小体出现在热激因子AtHsfA1a表达量低的基因沉默型植株中，初步推测低温胁迫下拟南芥热激因子AtHsfA1a对细胞程序性死亡有一定的抑制作用。

23拟南芥热激因子AtHsfA1a低温胁迫后对Caspase-3活性的影响[HT]

以热激因子AtHsfA1a不同基因型的细胞为试验材料，低温胁迫处理后，根据荧光底物Ac-DEVD-pNA的断裂程度测定Caspase-3活性。从图4中可以看出，与25 ℃处理相比，经过低温4 ℃处理1h后，野生型拟南芥和沉默型拟南芥Caspase-3活性均明显增强，但基因沉默型拟南芥Caspase-3活性高于野生型拟南芥的Caspase-3活性，这与图2的热激因子AtHsfA1a的表达量呈负相关，说明拟南芥热激因子AtHsfA1a在低温胁迫下对Caspase-3活性有抑制作用。

3讨论与结论

近年来的研究发现，在正常环境中，HSF主要以无活性单体的形式存在，受到逆境胁迫时，单体向有活性的同源三聚体形式转变，三聚体能与热激元件结合，从而导致抗逆基因的表达[3-5]。本研究采用]AtHsfA1a基因沉默的转基因植株为试验材料，该植株是利用RNA干扰技术将2个反向重复的[WTBX][STBX] C-AtHsfA1a 序列克隆到植物发夹RNA表达载体中，从而筛选出稳定、有效的内源]AtHsfA1a基因沉默的转基因拟南芥植株。通过RT-PCR方法检测低温胁迫后热激因子AtHsfA1a的表达情况，结果表明，尽管低温处理后不同基因型热激因子AtHsfA1a的表达量均会增加，但是与野生型相比，]AtHsfA1a基因沉默型植株在低温胁迫后表达量明显较少。表达量的减少势必会影响热激因子AtHsfA1a执行生理功能。植物在逆境中会发生细胞程序性死亡，本研究结果也表明，低温胁迫后野生型细胞核开始发生变化，但未出现凋亡小体，而基因沉默型的细胞出现了细胞凋亡小体，细胞程序性死亡凋亡小体出现在热激因子AtHsfA1a表达量低的基因沉默型植株中，表明冷胁迫下拟南芥热激因子AtHsfA1a对细胞程序性死亡有一定的抑制作用。至于拟南芥热激因子AtHsfA1a是如何抑制细胞程序性死亡的，涉及复杂的生化基础。研究发现各种富含半胱氨酸Caspase被激活后，能够在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割，从而造成细胞程序性死亡，其中 Caspase-3是凋亡信号通路中一个重要的蛋白酶，也是凋亡的关键执行分子[12]。Caspase-3正常以酶原（32 ku）的形式存在于胞浆中，没有活性。在凋亡的早期阶段，Caspase-3被激活；活化的Caspase-3由2个大亚基（17 ku）和2个小亚基（12 ku）组成，裂解相应的胞浆、胞核底物，最终导致细胞凋亡[13]。关于热激因子AtHsfA1a抑制PCD是否与 Caspase-3活性有关需要深入研究。为了研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对低温胁迫下细胞程序性死亡中Caspase-3活性的影响，探究拟南芥热激因子AtHsfA1a与逆境中PCD的关系，本试验将AtHsfA1a不同基因型（野生型、沉默型）的拟南芥幼苗于4 ℃低温处理1h后，在用RT-PCR技术分析拟南芥热激因子AtHsfA1a表达量和观察细胞形态的基础上，根据荧光底物Ac-DEVD-pNA的断裂程度，测定Caspase-3的活性，经过低温处理后的拟南芥类Caspase-3活性明显增强，说明低温可以诱导细胞程序性死亡。而结果也显示，基因沉默型拟南芥类Caspase-3活性相对较高，野生型拟南芥类Caspase-3活性相对较低，与热激因子AtHsfA1a的表达量呈负相关，说明低温胁迫下热激因子AtHsfA1a抑制拟南芥Caspase-3蛋白酶的活性。至于热激因子AtHsfA1a影响Caspase-3蛋白酶活性是通过调控细胞程序性死亡其他基因的表达来调控Caspase-3蛋白酶活性大小，还是直接调控Caspase-3蛋白酶表达，还需要通过染色质免疫沉淀分析、凝胶阻滞电泳及酵母双杂交等方法进行进一步研究。本研究初步表明，热激因子AtHsfA1a可能通过抑制类Caspase-3蛋白酶的活性而对细胞程序性死亡有一定的抑制作用，从而保护植物免受逆境的伤害。从分子水平鉴定拟南芥热激因子AtHsfA1a与逆境中PCD关键基因[WTBX][STBX]Caspase-3的关系，对于揭示植物抗逆机制具有重要的意义。endprint

參考文献：

[1][ZK（#]Akkerfelt M，Morimoto R I，Sistonen L Heat shock factors：integrators of cell stress，development and lifespan[J] Nature Reviews：Molecular Cell Biology，2010，11（8）：545-555

[2]Kotak S，Larkindale J，Lee U，et alComplexity of the heat stress response in plants[J] Current Opinion in Plant Biology，2007，10（3）：310-316

[3]von Koskull-Dring P，Scharf K，Nover L The diversity of plant heat stress transcription factors[J] Trends Plant Sci，2007，12（10）：452-457

[4]Li M，Doll J，Weckermann K，et al Detection of in vivo interactions between Arabidopsis class A-HSFs，using a novel BiFC fragment，and identification of novel class B-HSF interacting proteins[J] Eur J Cell Biol，2010，89（23）：126-132

[5]Liu H C，Liao H T，Charng Y Y The role of class A1 heat shock factors （HSFA1s）[KG23]in[KG23]response[KG23]to[KG23]heat and other stresses in Arabidopsis[J] Plant Cell Environ，2011，34（5）：738-751[LM]

[6][ZK（#]Nover L，Bharti K，Dring P，et al Arabidopsis and the heat stress transcription factor world：how many heat stress transcription factors do we need？[J] Cell Stress Chaperones，2001，6（3）：177-189

[7]Dring P，Treuter E，Kistner C，et al The role of AHA motifs in the activator function of tomato heat stress transcription factors HsfA1 and HsfA2[J] Plant Cell，2000，12（2）：265-278

[8]PennellR I，Lamb C Programmed cell death in plants[J] Plant Cell，1997，9 （7）：1157-1168

[9]Lin J，Wang Y，Wang G Salt stress-induced programmed cell death in tobacco protoplasts is mediated by reactive oxygen species and mitochondrial permeability transition pore status[J] J Plant Physiol，2006，163（7）：731-739

[10][ZK（#]Xu C J，Chen K S，Ferguson I B Programmed cell death features in apple suspension cells under low oxygen culture[J] Bioscience & Biotechnology，2004，5（2）：137-143

[JP2][11]Gechev T S，Van Breusegem G F，Stone J M，et al Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death[J] BioEssays，2006，28（11）：1091-1101

[12]Gechev T S，Hille J Hydrogen peroxide as a signal controlling plant programmed cell death[J] J Cell Biol，2005，168（1）：17-20

[13]Thonel A D，Mezger V，Garrido C Implication of heat shock factors in tumorigenesis：therapeutical potential[J] Cancers，2011，3：1158-1181

[14]Jacobs A T，Marnett L J HSF1-mediated BAG3 expression attenuates apoptosis in 4-hydroxynonenal-treated colon cancer cells via stabilization of anti-apoptotic Bcl-2 proteins[J] J Biol Chem，2009，284（14）：9176-9183

[15]Beere H M ‘The stress of dying：the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis[J] J Cell Sci，2004，117：2641-2651

[16]Ahn S G，Thiele D J Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress[J] Genes and Development，2003，17（4）：516-528

[17]Guo L H，Cai J，Yu Z X，et al Influence of High Temperature on the Expression of Arabidopsis Heat Shock Transcription Factor ]AtHsfA1a[J] Agricultural Biotechnology，2013，2（12）：13-15

[18]Bradford M MA rapid and sensitive method for the quantification of microdram quantities of protein sutilizing the principle of protein-dye-binding[J] AnalytBiochem，1976，44：276-287

[19]Zhang L，Jiang H，Gao X，et al Heat shock transcription factor 1 inhibits H2O2-induced apoptosis via down-regulation of reactive oxygen species in cardiac myocytes[J] Mol Cell Biochem，2011，347（12）：21-28endprint