耐寒月季染色体制片技术与核型分析

于新海++李濛++周红昕++才源

摘 要：通过实验发现由吉林省生物研究所提供的耐寒月季其核型组成为K（2n）=2x=14m，通过阅读文献确定蔷薇属植物的染色体基数为7，即该材料为具有14条染色体的2倍体植株。目前普遍的现代栽培观赏月季均为四倍体植株，无法与该耐寒月季进行杂交育种。而该耐寒月季具有耐寒性直立性好、抗病性强、花期长、花型优美等宝贵特点，所以通过生物技术手段进行染色体倍数确定，为后续获得四倍体植株和与现代四倍体观赏月季杂交育种奠定理论基础和实验依据。

关键词：耐寒月季；染色体；核型分析

中图分类号：K915 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20171132013

月季花属于蔷薇属（Rosa L.）植物，由于其花期长、花色丰富，品种多样，深得人们的喜爱[1]。在很久之前就已成为世界著名的观赏植物，同时在园林绿化方面也得到广泛的应用。但由于东北很多地区的气候条件的特殊性，冬季寒冷干燥、春季经常出现倒春寒等气候，所以具有优良的抗旱性、抗寒性同时兼具观赏性的月季品种少之又少[2]。本实验中的蔷薇属植物耐寒月季，由吉林省生物研究所提供，此品种月季耐寒性极好，具有与野生蔷薇资源共同的有点：抗病性和直立性生长强，并且其花期可以从5月份延续到10月中旬左右，花色为粉色，多瓣，在冬季可完全裸露过冬，在第2年春季又可从地上部分继续生长[3]。但品种过于单一，像这种花量大、花期长、耐寒性好、抗病性强的优良月季，其花色只有粉色花一种。为了丰富这种优良性状月季的品种，特此做了杂交试验的基础研究：染色体倍数分析[5]。

由于月季花的须根木质化程度高，根尖部分很难找到处于分生期的嫩芽，所以本次实验采用的实验材料为未形成花蕾的嫩茎部分[6]。

1 材料与方法

1.1 取材时间、地点

本次所取材料均为生长年龄长达5a以上的树状粉花耐寒月季的未形成花蕾的嫩茎[3]，分别与上午09：00、10：00、11：00点进行取材[7]，取材地點为吉林省生物研究所实验园区。

1.2 试验方法

1.2.1 实验仪器与药品

8-羟基喹啉25g，无水乙醇分析纯 500mL，冰醋酸 分析纯500ml，盐酸分析纯 500ml，碱性品红，石碳酸分析纯500g，甲醛分析纯 500ml，山梨醇 25g，奥林巴斯显微镜cx31，METTLER TOLEDO 电子天平，海尔4℃恒温冰箱。

2mmol/L的8-羟基喹啉水溶液：准确称取0.29g8-羟基喹啉，用5ml5mol/L的盐酸进行溶解，然后在1L的容量瓶中用蒸馏水进行定容。

卡诺固定液：量取无水乙醇750mL、冰乙酸250mL溶于一起。

卡宝品红溶液：先分别配成3种原液，再配成染色液[8]。

A液：准确称取碱性品红3g，溶解于100mL的70%乙醇溶液中。可放于4℃恒温冰箱内长期保存，以备以后使用。

B液：量取A液10mL，加入 90mL的5%苯酚水溶液中。B液在2周内使用。

C液：量取B液55mL，分别加入6mL的乙酸和甲醛溶液。

染色液：量取C液25mL，加入到75mL，45%的乙酸溶液中。称取1.8g山梨醇溶解于染色液中（此染色液可长期保存，以备后续使用）[9]。

1.2.2 实验材料处理

1.2.2.1 取材

本次实验是在7月份中选择天气晴朗的上午09：00、10：00和11：00不同时间段取样。所取样均为生长旺盛枝条未形成花蕾的茎尖部分，约0.5cm左右。将索取嫩茎去皮处理后切成薄片[10]。

1.2.2.2 预处理

将切好的嫩茎段用2mmol/L的8-羟基喹啉水溶液分别处理2～3h。

1.2.2.3 样品固定

将经过预处理后的嫩茎切片用蒸馏水水洗2～3次后放入卡诺固定液中进行固定。固定条件为4℃，60min[11]。

1.2.2.4 样品解离

本次实验是通过酸解法进行样品解离，用5mol/L的盐酸常温解离10min，也可用1mol/L的盐酸在60℃水浴锅中解离10min，经试验对比效果一致[12]。

1.2.2.5 染色

将进行解离后的嫩茎用蒸馏水反复冲洗3～5次后，放入卡宝品红染色液中进行染色2～3h。

1.2.2.6 制片

采用常规压片法，用镊子取经过染色的嫩茎段至于载玻片上，用滤纸一段吸取多余的水分然后盖上盖玻片。在固定好盖玻片后，用镊子另一端轻轻敲打盖玻片，使材料细胞分散均匀，以便于显微镜下观看[13]。

1.2.2.7 观察

将压好的载玻片置于低倍镜下进行观察，选择好合适的区域后再转入高倍镜下进行染色体计数。

2 实验结果与分析

选择10个分散良好且处于中期细胞的材料进行观察计数，确定上午10：00，11：00所取样中均有处于分裂中期的细胞且本品种耐寒月季共有14条染色体。核型公式为 K（2n）=2x=14m，未发现有随体。染色体形态见图1。

由吉林省生物研究所提供的耐寒月季为2倍体植株，无法进行与现代栽培的4倍体月季植株的杂交育种实验。所以需要通过染色体加倍技术，获得此品种的4倍体植株后再进行杂交育种实验，从而可以完成新品种的选育工作[14]。

3 总结

经过染色体倍数分析得出该品种耐寒月季为2倍体，而现代月季多为4倍体，在后续实验中可通过秋水仙素处理等方法使染色体加倍，得到4倍体植株。从而可以与花色丰富的现代月季进行杂交实验，并筛选出理想的耐寒、花色丰富、抗病性与直立性好的月季花[15]。本次实验为克服远缘杂交的不亲和性和不可育性奠定基础；染色体倍数及形态在一定条件下可以影响该物种的进化过程，例如染色体加倍就是一个重要因素，这对于种群与种间杂交后代的鉴定以及亲缘关系研究具有重要意义[16]。此外此种耐寒月季的种子萌发率极低，无法实现与观赏性较好的4倍体优良月季品种进行远缘杂交。因此，如何克服远缘杂交不亲和性及不育性，培育出观赏性好且抗性强的品种是当前育种工作亟待解决的关键问题。endprint

参考文献

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