miR-221在大鼠脑缺血再灌注神经损伤中的作用及其机制

孙瑛，刘一民，王玉，丁静，陈红兵

(潍坊医学院附属益都中心医院，山东潍坊262500)

miR-221在大鼠脑缺血再灌注神经损伤中的作用及其机制

孙瑛，刘一民，王玉，丁静，陈红兵

(潍坊医学院附属益都中心医院，山东潍坊262500)

目的探讨miR-221在大鼠脑缺血再灌注神经损伤中的作用及其可能机制。方法选择SD大鼠60只，随机分为假手术组、模型组和agomiR-221组，每组20只。模型组、agomiR-221组建立局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型。假手术组仅手术，不阻断血流。成模后agomiR-221组尾静脉注射agomiR-221(miR-221激动剂)80 mg/kg，模型组尾静脉注射等量agomiR-NC，假手术组不予处理。再灌注24 h，各组随机取6只，留取脑组织，采用TTC染色法观察脑梗死体积；另取6只，采用干湿重法计算脑组织含水量；剩余大鼠采用原位末端标记法计算细胞凋亡指数(AI)；Real-time PCR法检测脑组织miR-221 mRNA表达；Western blotting法检测脑组织炎症因子IL-1β、TNF-α及凋亡相关蛋白Caspase3表达。结果假手术组和agomiR-221组脑组织miR-211 mRNA相对表达量明显高于模型组，且agomiR-221组高于假手术组(P均<0.05)。与假手术组比较，模型组脑梗死体积、脑组织含水量及AI明显升高(P均<0.05)，而agomiR-221组脑梗死体积、脑组织含水量及AI较模型组明显降低(P均<0.05)。与假手术组比较，模型组炎症因子IL-1β、TNF-α以及凋亡相关蛋白Caspse3表达明显升高(P均<0.05)，而agomiR-221组炎症因子IL-1β、TNF-α以及凋亡相关蛋白Caspse3表达较模型组明显降低(P均<0.05)。结论过表达miR-221对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，其机制可能与调控炎症反应和细胞凋亡有关。

脑缺血再灌注损伤；微小RNA-221；细胞凋亡；炎症因子；凋亡因子；大鼠

脑缺血再灌注损伤(CIR)是指各种原因导致脑组织血流中断，闭塞的脑血管再通后缺血性损伤却进一步加重的现象，是一个由多因素参与的复杂病理生理过程。目前CIR的发生机制主要包括细胞凋亡学说、炎症反应学说、兴奋性氨基酸学说以及自由基学说等[1]。炎症反应和细胞凋亡是诱导CIR后神经细胞损伤的主要因素。微小RNA(miRNA)是一组广泛存在于生物体中不编码蛋白质的短序列RNA，能与特定基因的mRNA 3′非编码区相结合，阻碍其翻译或直接使其降解，从而对目的基因进行调节[2]。大量研究证实，miRNAs与缺血性脑血管病关系密切[3，4]。miR-221是较早发现的miRNA家族成员之一，目前有关miR-221的研究主要集中在恶性肿瘤方面[5]。近期研究发现，缺血性脑卒中患者血清miR-221水平较健康者明显下降[3]。因此推测，miR-221在CIR的发生、发展过程中可能具有一定作用。2016年3～7月，我们观察了CIR大鼠脑组织miR-221表达变化，现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠60只，清洁级，3月龄，体质量280～300 g，由北京维通利华动物实验中心提供，合格证号：SCXK(京)2006-0009。所有大鼠标准饮食、自由摄水，湿度55%～60%，温度22～24 ℃，模拟正常昼夜交替的环境饲养。TRIzol试剂，美国Invitrogen公司；miR-221激动剂agomiR-221、阴性对照agomiR-NC，广州锐博生物科技有限公司；逆转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)及荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq TM)，日本TaKaRa公司；所有引物由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成。IL-1β、TNF-α、Caspase3兔抗鼠多克隆抗体，美国Abcam公司；GAPDH兔抗鼠多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，武汉博士德生物工程有限公司；原位末端标记(TUNEL)检测试剂盒、Light Cycler PCR仪，美国罗氏公司。

1.2 模型制备及分组干预 所有大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法分为假手术组、模型组、agomiR-221组，每组20只。模型组、agomiR-221组采用改良尼龙线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型[6]：10%水合氯醛腹腔注射麻醉，颈正中切口纵行剪开皮肤，分离皮下组织，结扎右侧颈总动脉近心段，于颈总动脉分叉处结扎颈外动脉，用微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，在距离颈总动脉分叉部2 mm处，剪开一小口，将前端包裹石蜡的鱼线插入颈内动脉，插入深度从颈总动脉分叉部算起约18 mm，固定线栓，松开微动脉夹。假手术组基本操作同模型组和agomiR-221组，但不插入线栓，不阻断血流。模型组和agomiR-221组阻断血流120 min，将线栓拔除，恢复血流灌注。再灌注24 h，按Zea-Longa 5分制评分标准[7]评价神经功能，评分1～3分为模型制备成功。模型组和agomiR-221组各成模18只。成模后agomiR-221组阻断血流同时尾静脉注射agomiR-221 80 mg/kg，模型组阻断血流同时尾静脉注射等量agomiR-NC，假手术组不予处理。

1.3 相关指标观察

1.3.1 脑梗死体积及脑组织含水量 ①脑梗死体积：采用TTC染色法[8]。再灌注24 h，各组随机取6只，10%水合氯醛800 mg/kg麻醉后，断颈处死，完整取出脑组织，以视交叉前4 mm开始每间隔2 mm做连续冠状切片，每个脑组织切片5张，迅速浸入2% TTC染液，37 ℃恒温水浴中孵育30 min，4%多聚甲醛固定24 h，拍照，利用Image J图像分析软件测定脑梗死面积(红色区域为正常脑组织，苍白色区域为梗死区)，脑梗死体积=各层梗死面积之和×层间隔。②脑组织含水量：采用干湿重法。各组随机另取6只，快速断颈处死，取大脑组织，沿脑中线切取缺血侧脑半球，用滤纸将脑组织表面的液体吸干，立即在电子分析天平上称湿重；置入110 ℃烤箱中烘烤24 h，称干重，计算脑组织含水量。脑组织含水量=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%。

1.3.2 大脑皮质神经细胞凋亡情况 采用TUNEL法。各组剩余大鼠10%水合氯醛800 mg/kg麻醉，断颈处死，取大脑组织常规制作石蜡切片，并按TUNEL试剂盒说明书操作进行染色。凋亡细胞TUNEL染色阳性，呈棕黄色，椭圆形或圆形，核固缩，偶见核碎裂。在光学显微镜下，选取不重复的5个400倍视野，应用显微图像分析系统计数每个视野中凋亡细胞数和细胞总数，计算细胞凋亡指数(AI)。AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.3.3 脑组织miR-221 mRNA表达 采用Real-time PCR法。取各组剩余大鼠缺血侧大脑皮质100 mg，TRIzol法提取脑组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，OD260/OD280为1.8～2.1。按逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列：miR-221上游引物：5′-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3′，下游引物：5′-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3′。参照Real-time PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性3 s，56 ℃退火34 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-221 mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 脑组织IL-1β、TNF-α、Caspase3蛋白表达 采用Western blotting法。取各组剩余大鼠缺血侧大脑皮质100 mg，加入裂解液，充分研磨裂解，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，BCA法蛋白定量后加入上样缓冲液混匀，100 ℃水浴15 min，使蛋白充分变性。蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗(IL-1β 1∶1 000，TNF-α 1∶1 000，Caspase3 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000)4 ℃摇床孵育过夜，次日洗膜，加入HRP标记的二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，洗膜，ECL发光，曝光显影。采用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以目的蛋白电泳条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组脑梗死体积、脑组织含水量比较 见表1。

表1 各组脑梗死体积及脑组织含水量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 各组大脑皮质神经细胞凋亡情况比较 假手术组脑组织切片偶见TUNEL染色阳性细胞，AI为(2.38±0.41)%；模型组可见大量TUNEL染色阳性细胞，AI为(38.46±5.89)%；agomiR-221组TUNEL染色阳性细胞较模型组明显减少，AI为(22.71±4.67)%。agomiR-221组和模型组AI均高于假手术组，且模型组高于agomiR-221组(P均<0.05)。

2.3 各组脑组织miR-221表达比较 假手术组、模型组和agomiR-221组脑组织miR-211 mRNA相对表达量分别为1.01±0.03、0.44±0.09、3.11±0.18。假手术组和agomiR-221组脑组织miR-211 mRNA相对表达量明显高于模型组，且agomiR-221组高于假手术组(P均<0.05)。

2.4 各组脑组织IL-1β、TNF-α、Caspase3蛋白表达比较 见表2。

表2 各组脑组织IL-1β、TNF-α、Caspase3蛋白相对表达量比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

脑缺血可导致中枢神经系统大量神经细胞的缺失和神经网络受损，在短期内恢复血流灌注，神经系统损伤却进一步加重，这种现象被称为CIR。CIR对机体造成的损伤远远超过缺血损害，其作用机制尚不完全清楚。

近年研究发现，miRNA可能参与调控CIR的病理过程。有学者采用microarray方法对脑卒中患者和正常人的外周血检测发现，多种miRNA在脑卒中急性期出现变异[9，10]；在缺血再灌注模型大鼠脑组织内也发现多种miRNA的变异[11]。Yin等[12]研究发现，MCAO模型大鼠脑组织miR-497表达升高，抑制miR-497表达可明显减少脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积。Jeyaseelan等[13]利用基因芯片技术检测脑缺血再灌注大鼠脑组织miRNA表达，发现30余种miRNA表达发生明显变化，并认为这些miRNA可能参与了CIR过程。miR-221基因位于染色体Xp11.3附近，在血管生成过程中具有重要作用[14]，且与恶性肿瘤的发生、发展有关[8]。目前，国内外关于miR-221与CIR关系的研究甚少。Tsai等[3]研究发现，缺血性脑卒中患者血清miR-221表达降低，提示miR-221可能与脑缺血性损伤有关。本研究结果显示，模型组脑组织miR-221表达明显低于假手术组，表明miR-221表达降低可能与CIR的发生有关。为进一步明确miR-221在CIR大鼠中的作用，本研究通过尾静脉注射miR-221激动剂agomiR-221，成功构建体内过表达miR-221的MCAO大鼠模型；结果发现，agomiR-221组CIR后AI、脑梗死区体积及脑组织含水量均明显低于模型组，表明过表达miR-221可显著改善CIR。

CIR的发生机制尚不完全明确，涉及氧自由基、钙超载、能量代谢异常、炎症反应及细胞凋亡等方面。炎症反应和细胞凋亡可能是CIR后神经细胞损伤的主要原因，其中关系最为密切的炎性因子有IL-1β、IL-6和TNF-α等。本研究结果显示，模型组脑组织IL-1β、TNF-α蛋白表达较假手术组明显升高，而agomiR-221组较模型组明显降低，表明miR-221可能通过调控炎性因子IL-1β、TNF-α表达，继而抑制CIR。Caspases是细胞凋亡的启动者和执行者，Caspase3是Caspases家族最关键的凋亡蛋白酶。本研究结果显示，模型组脑组织Caspase3蛋白表达较假手术组明显升高，而agomiR-221组Caspase3蛋白表达较模型组明显降低，表明miR-221可能通过调控Caspase3表达继而抑制CIR。以上结果表明，miR-221可能通过调控炎症反应和细胞凋亡参与抑制CIR进程。

综上所述，miR-221过表达对大鼠CIR具有神经保护作用；其机制可能与调控炎症反应和细胞凋亡有关。

[1] Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury[J]. J Pathol, 2000,190(3):255-266.

[2] Pasquinelli AE. MicroRNAs and their targets: recognition, regulation and an emerging reciprocal relationship[J]. Nat Rev Genet, 2012,13(4):271-282.

[3] Tsai PC, Liao YC, Wang YS, et al. Serum microRNA-21 and microRNA-221 as potential biomarkers for cerebrovascular disease[J]. J Vasc Res, 2013,50(4):346-354.

[4] Gan CS, Wang CW, Tan KS. Circulatory microRNA-145 expression is increased in cerebral ischemia[J]. Genet Mol Res, 2012,11(1):147-152.

[5] Wang YC, Liu JS, Tang HK, et al. miR-221 targets HMGA2 to inhibit bleomycin-induced pulmonary fibrosis by regulating TGF-β1/Smad3-induced EMT[J]. Int J Mol Med, 2016,38(4):1208-1216.

[6] 尉娜，李静，李娟，等.腺苷预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及其机制[J].山东医药，2016，56(20)：33-35.

[7] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[8] Feng C, Fan X, Zhang C， et al. On the quantitative analysis of focal ischemic cerebral infarction by TTC staining[J]. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi, 2009,26(6):1363-1366.

[9] Sørensen SS, Nygaard AB, Nielsen MY, et al. miRNA expression profiles in cerebrospinal fluid and blood of patients with acute ischemic stroke[J]. Transl Stroke Res, 2014,5(6):711-718.

[10] Liu DZ, Tian Y, Ander BP, et al. Brain and blood microRNA expression profiling of ischemic stroke, intracerebral hemorrhage, and kainate seizures[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2010,30(1):92-101.

[11] Lei P, Li Y, Chen X, et al. Microarray based analysis of microRNA expression in rat cerebral cortex after traumatic brain injury[J]. Brain Res, 2009(1284):191-201.

[12] Yin KJ, Deng Z, Huang H, et al. miR-497 regulates neuronal death in mouse brain after transient focal cerebral ischemia[J]. Neurobiol Dis, 2010,38(1):17-26.

[13] Jeyaseelan K, Lim KY, Armugam A. MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion[J]. Stroke, 2008,39(3):959-966.

[14] Meier P, Schirmer SH, Lansky AJ, et al. The collateral circulation of the heart[J]. BMC Med, 2013(11):143.

陈红兵(E-mail： chb0536@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.012

R743

A

1002-266X(2017)40-0045-03

2016-12-16)