云贵高原银星竹鼠的遗传多样性与遗传结构研究

丁雪梅， 颜岳辉， 刘潮， 王海波， 唐利洲*

(1.西南林业大学，昆明 650224； 2. 曲靖师范学院，云南高原生物资源保护与利用研究中心，云南曲靖 655011)

云贵高原银星竹鼠的遗传多样性与遗传结构研究

丁雪梅1， 2， 颜岳辉1， 2， 刘潮2， 王海波2， 唐利洲2*

(1.西南林业大学，昆明 650224； 2. 曲靖师范学院，云南高原生物资源保护与利用研究中心，云南曲靖 655011)

作为一类营地下生活的啮齿动物，银星竹鼠Rhizomyspruinosus具有较高的食用价值和药用价值，已成为我国南方地区特种经济动物养殖业的重点发展物种。以核内重组蛋白激活基因1(RAG1)的基因片段为分子标记，采用分子生物学方法，本研究对来自12个采样点的173个银星竹鼠个体进行群体遗传分析，探讨该物种群体遗传多样性和遗传结构。序列多态性分析结果显示，银星竹鼠RAG1基因部分序列848 bp，共检测出多态性位点18个，其中单突变位点3个，简约信息位点15个。遗传多样性分析表明，173份样本共统计出RAG1基因单倍型11个，单倍型多样性为0.712±0.025，核苷酸多样性为0.002 64±0.003 71，显著低于其他啮齿动物。最大似然法、邻接法和贝叶斯法构建的系统发育树显示，银星竹鼠群体分化为3个分支，其谱系地理格局出现明显分化。同时，分子变异分析结果证实，银星竹鼠种群间的遗传变异极显著高于种群内的，说明该物种存在显著的遗传结构和遗传分化水平。上述研究结果综合表明，银星竹鼠群体的遗传多样性水平较低，遗传分化结构较为显著，这可能与该物种的地下生活方式、扩散能力弱、山脉河流阻隔作用、地质气候事件等因素有关。本研究结果将为云贵高原地区物种多样性、生物多样性保护提供科学的参考依据。

银星竹鼠；重组激活蛋白基因1；遗传多样性；遗传结构；云贵高原

银星竹鼠Rhizomyspruinosus，又名花白竹鼠、粗毛竹鼠，隶属啮齿目Rodentia鼹形鼠科Spalacidae竹鼠亚科Rhizomyinae竹鼠属Rhizomys，为营地下生活的小型哺乳动物，主要分布于我国华南、西南广大地区以及东南亚等国的竹林和芒草地生境(徐龙辉，1984；Wilson & Reeder，2005；Linetal.，2014；胡舒展，2016)。该物种扩散迁移能力较弱，大多数栖息生境处于海拔1 000 m以下，且必须有主要食物——竹类和芒类植物分布(徐龙辉，1984；陈松等，2000；卓智龙，2012)。有关银星竹鼠的基础研究主要涉及其行为学、动物地理学和形态学等，并已基本探明了该物种的形态特征、分布区域、栖息环境、洞穴结构、行为习性、食性和繁殖特性(黄季琦等，1957；张荣祖等，1958；徐龙辉，1984；卓智龙，2012)。亦有研究人员对该物种的染色体组型、体内寄生的马尔尼菲青霉菌、生理生化指标及人工驯养等进行了相关研究(徐龙辉，1984；李菊裳，1986；黄满盈，陆含华，1990；张旋等，1996；吴易等，2004；罗宏等，2008；庄晓晟，2008；宋兴超，2009；张容芳等，2011；张勇等，2012；卓智龙，2012；陈永军等，2014；何国庆等，2015)，但研究工作尚较为基础。Zhao等(2013)采用分子生物学方法测定了银星竹鼠的线粒体基因组，并与盲鼹鼠Spalaxcarmeli和高原鼢鼠Eospalaxbaileyi进行了比较分析。除此之外，有关银星竹鼠分子生态学和群体遗传学等的研究工作还未见报道。

银星竹鼠属国家保护的有益的或者有重要经济价值和科学研究价值的陆生野生动物，已被报道兼有较好的食用价值和药用价值，成为我国南方地区特种经济动物养殖业的重点发展物种(陈永军等，2014；何国庆等，2015)。目前，人工驯化养殖和规模化养殖群体的繁殖、病害防控、纯繁保种等都必须掌握群体的遗传背景资料，否则大量的人工驯养和繁殖容易导致银星竹鼠近交衰退、品种退化、遗传多样性丧失等不良后果，严重制约养殖业及产业化的持续健康发展。值得重视的是，近年来，受到森林砍伐、生境破坏、环境污染及乱捕滥杀等不良因素的综合影响，野生动物类群的生存状况及物种多样性面临着巨大的挑战，野生群体的分布范围已明显缩减，地理种群的个体数量已显著下降，人类活动干扰的加剧势必对物种的遗传多样性造成不可估量的影响(黄康，2014；刘铸，2014)。

随着分子生物学技术的发展，已有研究表明线粒体基因属单亲遗传，而核基因DNA为双亲遗传标记，能够更全面地代表双亲的进化历史和遗传信息，其中DNA重组激活基因1(recombination activating gene 1，RAG1)是脊椎动物特异性免疫反应的关键核基因，已被广泛用于脊椎动物DNA水平序列分析和生态学研究(马春艳等，2012；袁小爱等，2012；Schenketal.， 2013)，但在银星竹鼠保护遗传学和分子生态学的研究中还未见报道。综上所述，本研究拟基于RAG1基因分析野生银星竹鼠群体的遗传多样性水平和遗传结构，揭示可能存在的潜在影响因素，从而为银星竹鼠的物种多样性保护及养殖业的遗传改良和品种选育提供有效的科学依据。

1 材料和方法

1.1样本采集

173份样本分别采自云南怒江、大理、保山、德宏、临沧、红河、普洱、西双版纳、玉溪、昭通以及四川雅安、福建龙岩(表1)。每份样品取肌肉组织约20 g，置于1.5 mL EP管中，用95%乙醇固定保存，带回实验室。

1.2基因组总DNA提取、PCR扩增与测序

采用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供的基因组DNA提取试剂盒抽提总DNA。

根据GenBank数据库已有银星竹鼠RAG1基因序列(KC953574.1)，由华大基因公司设计引物进行PCR扩增，引物序列为：RAG1F(5’-GACCTGGAAAGTCCAGTAAAGTCC-3’)；RAG1R (5’-CTTTTC-GTCATATCCGGTGCCC-3’)。反应体系50 μL：1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL，25 μL 2×Easy Taq PCR Supermix(TRANSGEN BIOTECH)，22 μL ddH2O。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。扩增产物混合2 μL 6×Loading buffer凝胶加样缓冲液在琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察拍照。PCR扩增产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。

1.3数据分析

利用Chromas 2.62 (Kyte & Doolittle，1982)、Seqman (Allex & Shavlik，1999)进行同源排序，并适当手动校对。利用DnaSP 5.10(Rozas & Rozas，1995)统计序列的保守位点、变异位点、单突变位点、简约信息位点、多态位点数。运行DnaSP 5.10分析群体单倍型多样性、核苷酸多样性及其标准差。以MrModeltest 2.2(Nylander，2004)估计核苷酸最适模型，以GenBank数据库下载的褐家鼠Rattusnorvegicus(NM053468.1)作为外群，利用MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)和MrBayes 3.2.5(Jahneretal.，2015)分别构建银星竹鼠群体单倍型间的最大似然(Maximum Likelihood，ML)树、邻接(Neighbor-Joining，NJ)树和贝叶斯(Bayesian inference，BI)树。以 GTR+G为最优模型，对各分支置信度进行重复10 000次的自举值检验(bootstrap)构建ML树，并以距离法(distance method)重复10 000次构建NJ树。构建BI树选用最适模型GTR+G，运算1 000万代，每100代取样一次，去掉(burnin)运算开始25%的不可信区域，直到链的收敛，即分裂频率平均标准差(the average standard deviation of split frequencies)小于0.01停止运算。用Tree View 1.6.6(Weir，1990)查看并编辑BI树。运行NETWORK 5.0(Richardsetal.，1996)，利用中连法(Median-joining Method)构建银星竹鼠群体单倍型间的网络关系分支图。利用Arlequin 3.5(Excoffier & Lischer，2010)的分子变异分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)(Excoffieretal.，1992)模块进行群体遗传结构的分析。

表1 银星竹鼠采集样本的地理信息Table 1 The geographical information of Rhizomys pruinosus samples

2 结果

2.1序列比对与多样性信息

银星竹鼠173份样本的RAG1基因序列测定结果显示，获得RAG1基因部分序列长度848 bp，其中保守位点830个，变异位点共18个，包括单突变位点3个，简约信息位点15个，无插入、缺失位点。银星竹鼠群体的核苷酸多样性为0.002 64±0.003 71，173条序列共检测出单倍型11个(Hap1～Hap11，登录号：MF318512～MF318522)，单倍型多样性为0.712±0.025。

2.2系统发生关系

系统发生关系的ML树、NJ树、BI树表明(图1)，银星竹鼠群体分化为3个地域性分支，即单倍型Hap1、Hap11组成第一分支，第二分支为Hap9，第三分支由Hap2～8和Hap10组成。NJ树和BI树构建了与ML树相同的拓扑结构(未显示)。由中连法构建单倍型间的网络分支图显示出与系统进化树相同的结果，银星竹鼠群体出现明显的地理种群分化(图2)。

2.3群体遗传结构

两类系统进化树的群体遗传结构AMOVA分析结果显示(表2)，银星竹鼠种群间的遗传变异组分为1.690 20，种群内的变异组分为0.279 60，二者占总遗传变异组分的比率分别为85.81%、14.19%，固定指数达到0.858 06，二者差异有高度统计学意义(P<0.001)。分析结果充分说明，种群间的遗传变异远远高于种群内，即银星竹鼠群体存在极显著的种群遗传结构与高水平的遗传分化。

3 讨论

遗传多样性分析结果表明，基于核基因RAG1的银星竹鼠群体单倍型多样性为0.712±0.025，核苷酸多样性为0.002 64±0.003 71。与此同时，云贵高原地区啮齿动物类群的遗传多样性研究结果显示，澜沧江姬鼠Apodemusilex群体单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.993、0.021，分别为银星竹鼠群体的1.39倍和7.95倍(Liuetal.，2012)。其次，青藏高原东南缘横断山区相关谱系地理研究结果同样表明，中华姬鼠Apodemusdraco群体的遗传分化明显，单倍型多样性和核苷酸多样性均较高，分别达到0.989和0.036 8(Fanetal.，2012)，为银星竹鼠群体的1.39倍和11.36倍。而同属地下啮齿动物类群的青藏高原高原鼢鼠和甘肃鼢鼠Eospalaxcansus的遗传多样性则有较大差异，高原鼢鼠群体的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.964和0.053，而甘肃鼢鼠的仅为0.953 2、0.006 36(Tang & Hafner，2010；蔡振媛等，2015)。银星竹鼠群体的核苷酸多样性显著低于地上鼠类(如姬鼠类)，亦低于同类地下鼠类(如鼢鼠类)且表现出极显著的谱系地理遗传结构。这种偏低的遗传多样性和明显的谱系格局可能与地下鼠类特殊的生活习性、扩散迁移能力、地质气候历史等密切相关(Tang & Hafner，2010；Fanetal.，2012；Liuetal.，2012；蔡振媛等，2015)。首先，与其他地下啮齿动物相似，银星竹鼠营地下掘土生活，具有较强的领域性，主要依赖地下洞道系统扩散和寻找食物，扩散迁移能力相对较弱，可能造成其群体内基因交流相对受限，继而出现显著的群体谱系地理分化格局(蔡振媛等，2015；刘丽，2016；苏军虎等，2017)。其次，银星竹鼠的生境为云贵高原地区的高山竹林区和芒草分布区，而此类区域相对地质地貌独特、气候环境多样、山脉河流分布集聚，独特的典型生境特征可能造成其群体内种群间的地理隔离，而隔离生境有可能成为群体显著性遗传结构形成的主要外在因素，这在其他地下啮齿动物类群的相关研究中得到了证实(蔡振媛等，2007，2015；周乐等，2007；方铁，2009；Tang & Hafner，2010；刘铸，2014；苏军虎等，2017)。最后，已有研究表明，云贵高原及其毗邻地区更新世的气候变化、地质运动及主要冰期事件成为影响该地域动物类群种群爆发、遗传分化、谱系结构和遗传多样性形成的主要原因(Chenetal.，2010；Lietal.，2012；Liuetal.，2012；Yueetal.，2012)，这也同样有可能成为银星竹鼠遗传多样性较低和显著性遗传结构产生的重要历史因素，这有待在今后的研究中进一步验证。

表2 银星竹鼠群体遗传结构AMOVA分析Table 2 AMOVA analysis of genetic structure in Rhizomys pruinosus populations

图1 银星竹鼠群体单倍型间的最大似然树Fig. 1 The Maximum Likelihood tree of Rhizomys pruinosus haplotypes

分支以上的数字分别是邻接树和贝叶斯树的自举值； 而最大似然树自举值显示在分支的下面。

The numbers above the branches are the bootstrap values of Neighbor-Joining tree and Bayesian inference tree， respectively； Maximum Likelihood tree bootstrap values are shown under the branches.

图2 银星竹鼠群体的单倍型网络图
Fig. 2 The median-joining network relationship ofRhizomyspruinosushaplotypes

每个实心圆圈代表一种单倍型； 实心圆大小与单倍型频率呈正比； 圆圈代表缺失单倍型； 每条线代表1步突变。

Each solid cycle means a haplotype； the size of solid circles is proportional to haplotype frequency； the cycle represents missing haplotypes (not sampled or extinct)； each line represents one mutation step.

总而言之，本研究中的银星竹鼠群体存在显著的谱系地理结构和较低的遗传多样性水平，其成因可能与其地下生物学特征有关，同样有来自地质历史气候事件和地理隔离作用的综合影响。然而，本研究仅用了核基因为标记进行银星竹鼠群体遗传多样性水平、遗传结构及其成因的分析，其分子标记可能存在一定的局限性，可以采取多态性更高和信息量更大的分子标记方法，如微卫星、单核苷酸多态性、简化基因组测序等。因此，今后的研究还需要将多个分子标记相结合，以更广泛的样点覆盖区域，获取更全面的银星竹鼠群体遗传学信息，为其保护遗传学和分子生态学等研究工作的开展及家养群体的遗传改良提供更有效的基础数据。

致谢：本研究受云南省高校云贵高原动植物多样性及生态适应性进化重点实验室、云南省高校云南特境内生菌资源开发与利用科技创新团队的资助，在此一并予以感谢!

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StudyonGeneticDiversityandGeneticStructureofRhizomyspruinosus

DING Xuemei1， 2， YAN Yuehui1， 2， LIU Chao2， WANG Haibo2， TANG Lizhou2*

(1. Southwest Forestry University， Kunming 650224， China； 2. Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan Province 655011， China)

As a subterranean fossorial rodent，Rhizomyspruinosushas high edible and medicinal value and has become an important animal species for the development of special economic animal breeding industry in South China. By using molecular biological methods， this research intends to adopt a molecular marker of nuclear recombination activating gene 1 (RAG1) to investigate the population genetics of 173 individuals from 12 sampling sites， as well as the genetic diversity and phylogeographical structure ofR.pruinosus. Polymorphism analysis ofR.pruinosusRAG1 gene showed that there were 18 polymorphic sites in the total 848 bp， including 3 single mutation sites and 15 parsimony informative sites. The results of genetic diversity analyses discovered that there were 11 haplotypes from 173 individuals’ estimation. The haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.712±0.025 and 0.002 64±0.003 71， respectively， and these were all significantly lower than that from the estimates of other rodents. The phylogenetic trees constructed by the methods of Maximum Likelihood， Neighbor-Joining and the bayesian tree showed that，R.pruinosusgroups diverged to three clades， indicating that obvious differentiation happened in the phylogeographical pattern of this species. In addition， the results of molecular variance analyses approved that the genetic variation among the populations ofR.pruinosuswas extreme significantly higher than that within populations. This suggested that there were significant differentiation of genetic diversity and genetic structure in total groups of this species. These results comprehensively showed that there were low genetic diversity and remarkable genetic structure inR.pruinosusgroups， and these were related with the important factors of subterranean life style， weak distribution ability， mountain river barrier and geological events. These findings will provide a scientific basis for the species diversity and biodiversity protection in the Yunnan-Guizhou Plateau.

Rhizomyspruinosus； recombination activating gene 1； genetic diversity； genetic structure； Yunnan-Guizhou Plateau

10.11984/j.issn.1000-7083.20170168

2017-05-23接受日期2017-08-11

国家自然科学基金项目(31260087， 31460561)

丁雪梅(1995—)， 女， 硕士研究生， 主要从事野生动物多样性及保育研究， E-mail：13769857574@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：tanglizhou@163.com

Q75； Q959.837

A

1000-7083(2017)06-0657-06