曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)精子表面蛋白17(Sp17)基因克隆以及组织表达特异性分析*

周 林 李 颖 吕振明 史会来 吴常文 迟长凤①

(1.浙江海洋大学海洋科学与技术学院 国家海洋设施养殖工程技术研究中心 海洋生物种质发掘与利用国家地方联合实验室 舟山 316022;2.浙江省海洋水产研究所 舟山 316021)

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)精子表面蛋白17(Sp17)基因克隆以及组织表达特异性分析*

周 林1李 颖1吕振明1史会来2吴常文1迟长凤1①

(1.浙江海洋大学海洋科学与技术学院 国家海洋设施养殖工程技术研究中心 海洋生物种质发掘与利用国家地方联合实验室 舟山 316022;2.浙江省海洋水产研究所 舟山 316021)

精子表面蛋白17(Sp17)是参与受精过程的关键分子。本研究采用RT-PCR以及RACE技术克隆得到了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Sp17简称Sj-Sp17 cDNA的全长序列,序列全长1463bp,5′和3′非编码区分别为92bp和222bp,预测的开放阅读框(ORF)全长1149bp。编码的蛋白理论分子量为42.0548kDa,等电点4.66,是一种亲水性蛋白,不存在跨膜区以及信号肽序列,含有丰富的螺旋结构(54%)。同源氨基酸序列比对发现,与其他软体动物的相似性最高仅为44%,表明 Sp17在进化中并不保守。基于 Sp17氨基酸序列构建的系统进化分析表明,曼氏无针乌贼和加州双斑蛸(Octopus bimaculoides)进化关系最近。组织特异性分析发现Sp17在曼氏无针乌贼的生殖系统中均有较高的表达量,其中在精巢和储精囊中有显著表达。Sp17基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于深入研究其细胞定位以及生物学功能具有重要意义。

曼氏无针乌贼;Sp17;cDNA;生物信息学;real-time PCR

精子表面蛋白 17(Sp17)是一种最初定位于哺乳动物雄性个体生殖细胞表面的特异性自身抗原性物质,目前已经在兔(Richardsonet al,1994)、鼠(Konget al,1995)、人(Leaet al,1997)等物种中有过研究,并发现在同一个物种中编码成熟 Sp17的不同长度的mRNA都有相同的编码区序列,在功能上已被证实具有结合卵膜透明带,参与顶体反应,以及与葡聚糖、硫酸葡聚糖等大分子结合的作用(Richardsonet al,1994),是在受精过程中起关键作用的蛋白。除此之外在软体动物部分种类基因组序列中也发现了具有类似 Sp17结构的基因。根据其自身抗原特性,越来越多的研究表明 Sp17除了雄性生殖系统,在呼吸系统的纤毛细胞以及某些癌细胞组织中也有不同水平的表达(Grizziet al,2004),因此被作为一种候选的检测抗原而被应用于医学研究(De Jonget al,2002)。

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)属软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、乌贼科(Sepiidae)、无针乌贼属(Sepiella)。作为一种具有较高药用、食用价值的经济头足类,自20世纪80年代以来自然种群数量急剧下降(吴常文等,2010),众多学者对于其资源保护以及生殖发育进行了研究(李星颉等,1986;张建设等,2011)。在本实验中,我们首次克隆了编码曼氏无针乌贼 Sp17(定义为Sj-Sp17)的 cDNA全长序列,结合生物信息学分析探讨了Sj-Sp17基因以及蛋白结构与其可能存在的生物学功能的关系,并通过 real-time PCR技术分析了编码该蛋白的 mRNA在不同组织中的表达特异性,为进一步研究Sj-Sp17的细胞定位以及蛋白的生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 性成熟的曼氏无针乌贼雄性个体取自浙江温州苍南头足类种苗繁育基地,活体解剖取精巢、储精囊、输精管、前列腺、精荚、胃、肠、肝、鳃、视叶、脑、心脏、胰、肌肉共14种组织样品保存于 RNAstore中,以干冰装运至实验室,放置于–80℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂 RNAstore购自 CWBIO公司;RNAiso Plus、PCR Master Mix、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、SYBR Premix Ex TaqTMII Kit、SMARTTMRACE kit 均购自TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取以及cDNA第一链的合成 取保存于 RNAstore中的新鲜精巢组织 50—100mg,根据RNAiso Plus试剂说明书提取总RNA。cDNA的合成按照M-MLV (RNase H-)反转录试剂盒推荐的方法进行。

1.2.2 曼氏无针乌贼 Sp17基因核心片段的克隆根据已有的转录组数据,筛选并设计用于克隆Sj-Sp17基因核心片段的引物,序列如下:

表1 克隆Sp17基因所用引物Tab.1 Primers used in Sp17 gene clone

PCR 25μL体系根据PCR Master Mix试剂说明书进行加样,反应条件为:94℃预变性5min;94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s,35个循环;72℃延伸7min,12℃5min结束。PCR产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,含有目的片段的 PCR产物送至上海华大生物公司进行测序。

1.2.3 Sp17基因全长cDNA的克隆 根据上一步所得到的 Sj-Sp17基因核心序列,参考 SMARTTMRACE试剂盒的要求设计5’和3’RACE引物,见表2。

5’RACE 采用引物 SP17-5’Outer和试剂盒接头引物5’adapter以加尾的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增,然后以 SP17-5’Inner引物和5’adapter进行巢式PCR 第二轮扩增。3’RACE 采用引物 SP17-3’Outer和接头引物3’adapter进行第一轮PCR扩增,接着以引物SP17-3’Inner和3’adapter进行巢式PCR二轮扩增。PCR条件参考试剂盒说明书。PCR产物电泳检测并纯化回收,连接到 PMD18-T载体,后转化至 DH5α感受态细胞培养,挑取阳性克隆送至上海华大生物公司测序。

表2 Sp17基因RACE使用引物Tab.2 Primers used in RACE of Sp17 gene

1.2.4 曼氏无针乌贼 Sp17基因全长及序列分析将测序得到的片段通过DNAMAN软件进行拼接,并用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线工具预测基因的开放阅读框(ORF)位置;然后利用Expasy-ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)(Gasteigeret al,2003)将其翻译为氨基酸序列并预测蛋白的相对分子量和等电点;应用在线工具 SignaIP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)(Bendtsenet al,2004)以及 TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分别对其进行信号肽以及跨膜区的预测;NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)软件分析其磷酸化位点;保守结构域分析采用 NCBI在线搜索工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi);Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)(Thompsonet al,1997)对Sj-Sp17及其同源氨基酸序列进行比对,基于Sp17氨基酸序列分析不同物种之间的进化关系并利用贝叶斯法构建分子进化树。

1.2.5 曼氏无针乌贼精子表面蛋白Sp17的组织表达特异性分析 根据已知的 Sj-Sp17基因全长,在ORF区内设计用于real-time PCR的引物,选择曼氏无针乌贼β-actin基因(S.japonicaJN564496.1)作为内参基因,合成的引物经普通PCR验证,序列见表3。

表3 Sj-Sp17荧光定量引物Tab.3 Primers of Sj-Sp17 used in real-time PCR

各组织的RNA提取以及合成cDNA第一链的方法,如实验方法中 1.2.1节所述。反转录后的 cDNA利用核酸蛋白检测仪测定浓度,并取足量稀释到100ng/μL备用,real-time PCR加样体系及反应条件按照SYBR Premix Ex TaqTMII Kit产品说明书进行。

2 结果与分析

2.1 曼氏无针乌贼Sp17基因全长的获得

以曼氏无针乌贼精巢cDNA为模板,以SP17-1F/1R、SP17-2F/2R和SP17-3F/3R为引物扩增分别得到338bp、256bp和336bp的核心片段,拼接后根据该基因序列设计RACE引物,采用5′RACE和3′RACE方法分别获得了210bp和563bp的两个目的片段(图1)。

2.2 曼氏无针乌贼Sp17基因cDNA全长的序列特征

利用 DNAMAN软件将扩增得到的长度分别为338bp、256bp和336bp的核心片段以及 3’RACE和5’RACE长度分别为210bp和563bp的片段拼接得到Sj-Sp17基因全长cDNA 1463bp,预测ORF为1149bp,5’UTR区 92bp,3’UTR区 222bp,共编码 382个氨基酸(图2)。

图1 曼氏无针乌贼Sp17基因cDNA的扩增Fig.1 The amplification of Sp17 gene cDNA in S.japonica

2.3 曼氏无针乌贼Sp17氨基酸序列比对以及同源性分析

选用来自 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库的Sp17同源性序列与Sj-Sp17进行氨基酸比对,发现组成该蛋白的氨基酸序列中前 100个氨基酸比较保守。图3中列出部分氨基酸序列的比对结果,Sj-Sp17氨基酸序列和太平洋牡蛎(Crassostrea gigasXP_011412976.1)、海蜗牛(Aplysia californicaXP_012936202.1)、加州双斑蛸(Octopus bimaculoidesXP_014778086.1)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrataXP_013090015.1)、紫海胆(Strongylocentrotus purpuratusXP_011680588.1)以及囊舌虫(Saccoglossus kowalevskiiXP_006818979.1)的相似性分别为36%、36%、36%、31%、44%和38%。保守结构域的分析发现在不同物种的Sp17氨基酸序列中同一位置(12—50aa)均存在DD CABYR SP17结构域,此外还存在至少一个IQ结构域(图4)。采用mrBayes软件(Ronquistet al,2003)对曼氏无针乌贼和来自于NCBI数据库的65条氨基酸序列构建系统进化树(图5)。其中曼氏无针乌贼和加州双斑蛸位于同一进化支,证明其亲缘关系最近,头足类和其他软体动物例如太平洋牡蛎、海蜗牛、紫海胆等位于同一较大进化支。

2.4 曼氏无针乌贼Sp17基因的生物信息学分析

分析表明,Sj-Sp17基因编码的蛋白质包括320个亲水性氨基酸和54个疏水性氨基酸,为亲水性蛋白。理论分子量(MW)为42.0548kDa,等电点(pI)4.66。信号肽和跨膜区预测结果显示该蛋白无跨膜区(图6)以及信号肽结构(图7)。磷酸化位点分析表明,该蛋白存在45个可能发生磷酸化修饰的位点。采用Antheprot5.0软件(Geourjonet al,1991)对SP17蛋白的二级结构分析发现,该蛋白含有54%的螺旋(Helix),3%的折叠(Sheet),6%的转角(Turn)以及38%的无规则卷曲结构(Coil)(图8)。

2.5 曼氏无针乌贼Sp17组织表达特异性分析

通过real-time PCR的方法对Sj-Sp17基因在精巢、脑、储精囊等共14种组织中的表达特异性进行分析,以曼氏无针乌贼 β-actin基因(S.japonicaJN564496.1)作为内参基因,选取肌肉中的表达量作为参照,采用 2–ΔΔCt方法计算相对表达量,并用SPSS18软件进行显著性分析。实验结果表明,Sj-Sp17基因在性成熟时期的精巢、储精囊中均有显著表达(P＜0.05),其次在脑、精荚以及输精管中也有一定量的表达,而在其他组织中表达量极低(图9)。

图2 Sj-Sp17基因cDNA全长Fig.2 The full length of Sj-Sp17 cDNA

图3 Sp17氨基酸同源比对Fig.3 Multiple alignments of deduced amino acid sequences of Sp17

图4 Sp17结构域比对Fig.4 Comparison in protein domains of Sp17

图5 基于Sp17氨基酸序列构建的贝叶斯系统进化树Fig.5 Bayesian phylogenetic tree depicting the relationship of Sp17 amino acids sequence with other species

3 讨论

精子表面蛋白Sp17是一种高度保守的哺乳动物蛋白,可能作为结合透明带表面糖基的分子而参与到顶体反应中,并促进受精作用(Konget al,1995;Adoyoet al,1997)。克隆得到的1463bp的Sj-Sp17cDNA序列,对其开放阅读框编码的氨基酸分析发现没有跨膜结构,不存在信号肽,因此 Sp17不属于细胞内分泌蛋白。磷酸化位点分析表明,其氨基酸序列中存在多个潜在的发生磷酸化的位点,蛋白质的磷酸化在细胞信号转导中起重要作用(De Castroet al,2006),因此我们推测这些磷酸化位点可能是其潜在的完成生理功能的结构基础。保守结构域分析表明 Sj-Sp17及其同源蛋白结构中均含有一个DD CABYR SP17结构域以及多个IQ结构域(Cheneyet al,1992)。DD CABYR SP17结构域是一个同时存在于 CABYR以及 Sp17 N端的结构,它和依赖于cAMP的蛋白激酶A的R亚基(PKA RII)氨基酸序列高度相似(Frayneet al,2002),这一部分结构是形成蛋白二聚化以及与蛋白激酶 A锚定蛋白(AKAPs)相互作用所必需的(Tayloret al,1990),并且已有实验证明Sp17能够亲和AKAP3 (Leaet al,2004);IQ结构域含有保守的异亮氨酸以及谷氨酰胺残基,属于钙调素结合蛋白家族,钙调素结合蛋白在精子细胞中有大量的表达(Joneset al,1978),同时也被证实在例如精子发生(Moriyaet al,1993)、精子运动(Tash,1989)、精子获能(Adeoya-Osiguwaet al,1996)、顶体反应(Zaneveldet al,1991)和精卵融合(Courtotet al,1994)过程中发挥调节作用,因此我们推测 Sp17作用机理与其他同家族蛋白类似(Wascoet al,1989;Manjunathet al,1993;Trejoet al,1997),即在钙离子或者EDTA存在下结合钙调蛋白发挥生物学作用。Sp17中IQ结构域还可能与蛋白质磷酸化以及参与钙离子信号转导以调节 Sp17蛋白与透明带表面糖基的结合有关(Deloulmeet al,1997)。二级结构预测显示Sj-Sp17氨基酸中 IQ结构域部分含有丰富的 α-螺旋结构,钙调蛋白在稳定这一结构的过程中可能起着很重要的作用(Xieet al,1994;Gerendasyet al,1995),而且螺旋结构越丰富,此区域与钙调蛋白的亲和力也越大(阎虎生等,1991)。PEST (PEST-FIND Score=11.38)序列是一段含有丰富的脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸组成的短序列,与泛素化降解有关(Rechsteineret al,1996),Sj-Sp17氨基酸序列中317—337aa存在潜在的PEST序列,在Sp17以及其他含有钙调蛋白结合域(IQ)的蛋白质中均存在这样的结构(Barneset al,1995),实验证实顶体反应开始后Sp17蛋白表达量迅速增多(Richardsonet al,1994),随着反应进行,分子量较大的三联体蛋白逐渐减少,小分子量蛋白增加,因此,该 PEST序列可能与顶体反应中高分子量的Sp17蛋白剪切掉C端的部分序列以及钙调素结合位点而最终呈现出小分子量的蛋白增加有关。

图6 Sj-Sp17跨膜区预测结果Fig.6 The transmembrane region prediction of Sj-Sp17

图7 Sj-Sp17信号肽预测结果Fig.7 The signal peptide prediction of Sj-Sp17

图8 Sj-Sp17蛋白的二级结构预测Fig.8 The secondary structure prediction of Sj-Sp17

通过 Sp17基因的组织表达特异性分析发现,它在雄性生殖系统各组织中的表达量较其它组织更高,尤其是在精巢中的表达量最高,推测它可能与精子形成过程有关。通过对Sj-Sp17氨基酸序列及同源氨基酸序列的进化分析发现,它与加州双斑蛸进化关系最近,其次是太平洋牡蛎、海蜗牛、紫海胆以及扁形动物门的生物,与人以及狒狒的关系最远。通过对进化关系较近的物种 Sp17氨基酸序列比对发现,同源性最高仅为44%,说明Sp17在进化中并不保守。

图9 Sj-Sp17基因在不同组织的表达特异性Fig.9 Distribution of Sj-Sp17 mRNA in various tissues

4 结论

本文通过 RT-PCR以及 RACE技术克隆得到了1463bp的 Sj-Sp17cDNA全长序列,并对其编码的长度为382个氨基酸的蛋白质进行了一系列生物信息学分析,发现该蛋白不含信号肽以及跨膜区结构,氨基酸同源性最高仅为44%,说明 Sp17在进化中并不是很保守。进化分析表明Sj-Sp17与加州双斑蛸进化关系最近。通过对预测蛋白结构的分析结合前人的研究成果,我们推测Sj-Sp17可能也参与顶体反应并促进顶体反应的顺利进行,而组织特异性分析也显示Sj-Sp17在精巢以及储精囊中有显著表达,因此Sj-Sp17还可能与精子的形成以及成熟有关。Sj-Sp17作为一种重要的与生殖相关的蛋白,其成功的克隆以及组织表达特异性分析对于深入研究其生理功能以及作用机理具有重要意义,并为曼氏无针乌贼的种质保护以及育种繁殖研究提供一定的理论依据。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF SPERM SURFACE PROTEIN 17 (SP17)GENE INSEPIELLA JAPONICA

ZHOU Lin1, LI Ying1, LÜ Zhen-Ming1, SHI Hui-Lai2, WU Chang-Wen1, CHI Chang-Feng1
(1.National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture,National and Provincial Joint Laboratory of Exploration and Utilization of Marine Aquatic Genetic Resources,School of Marine Science and Technology,Zhejiang Ocean University,Zhoushan316022,China;2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang,Zhoushan316021,China)

Sperm surface protein 17 (Sp17)is a key molecular in fertilization process.A 1463bp full-length cDNA of Sp17 gene fromSepiella japonicadescribed as Sj-Sp17 was obtained with RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends(RACE)techniques.Sp17 consists of a 92bp 5′ untranslated region (UTR)and a 222bp 3′ UTR.The predicted open reading frame (ORF)is 1149bp,the molecular weight of deduced protein is 42.0548kDa,and itspIis 4.66.Sj-Sp17 is hydrophilic,has no signal peptide sequence and transmembrane regions,but contains rich spiral structures (54%).The deduced amino acid sequence that is aligned with other species Sp17 shows low similarity (＜44%),indicating that the structure of Sj-Sp17 is not conserved.Phylogenetic analysis based on Sp17 demonstrates thatS.japonicais closely related withOctopus bimaculoides.Sj-Sp17 gene was mainly expressed in reproductive system by real-time PCR analysis,and had significant expression especially in testis and seminal vesicle.We believe that cloning and analysis on tissue-specific expression of Sj-Sp17 gene would be of great significance for understanding its cellular localization and biological function.

Sepiella japonica;Sp17;cDNA;bioinformatics;real-time PCR

Q789;Q955

10.11693/hyhz20170300060

* 科技部港澳台科技合作专项,2014DFT30120号;浙江省自然科学基金项目,LY15C190010号;舟山市科技专项,2016C41016号;浙江省科研院所专项,2015F50055号;浙江海洋大学“海洋科学”省重中之重学科开放课题,20160116号。周 林,硕士研究生,E-mail:1527074150@qq.com

① 通讯作者:迟长凤,博士,教授,E-mail:chicf@zjou.edu.cn

2017-03-17,收修改稿日期:2017-04-15