芽孢杆菌aiiA基因抗病研究进展

陈珺君，闵勇，刘晓艳，杨自文，

（1.武汉大学生命科学学院，430072；2.湖北省农业科学院/湖北省生物农药工程研究中心）

芽孢杆菌aiiA基因抗病研究进展

陈珺君1，闵勇2，刘晓艳2，杨自文1，2

（1.武汉大学生命科学学院，430072；2.湖北省农业科学院/湖北省生物农药工程研究中心）

aiiA基因编码的AiiA蛋白是一类由芽孢杆菌产生的酰基高丝氨酸内酯酶，能够专一性地水解革兰氏阴性菌分泌的AHLs信号分子，从而破坏依赖群体感应系统的致病机制，减轻病原菌的致病性。综述了aiiA基因与AiiA蛋白的研究现状、aiiA基因在抗病方面的研究进展及AiiA蛋白在工业发展的应用现状等，以期为aiiA基因在更多领域的应用提供理论基础。

芽孢杆菌；群体感应；aiiA基因；N-酰基高丝氨酸內酯（AHLs）

1994年，Fuqua等[1]将细菌之间的一种细胞密度依赖的基因表达调控机制命名为群体感应（Quorum sensing，QS），其在能够生物发光（冷光）的海洋细菌——费氏弧菌（Vibrio fischeri）中被发现。研究证明，群体感应系统存在于许多细菌之中，参与自身的许多生理过程，并且与其致病性相关。该系统是一种被细菌所利用的的信号系统，通过对细胞密度的改变来调控许多动植物病原菌致病基因的表达。具体来说，细菌自身能够分泌一种小的化学信号分子，被称为自诱导物（Autoinducer，AI），具有可扩散性，可自由通过细胞壁和细胞膜。其随着细菌数量的增加而增加，当达到一个临界浓度时，细菌群体就会表现为一个多细胞生命体，通过响应信号分子来调控它们的群体行为，对高的细胞密度做出反应，从而表现出单个细菌无法从事的某些生物行为和生理功能，获得对自身有利的优势[2]。此外，研究者发现，细菌的群体感应与动植物病原菌毒性因子的产生、生物膜的形成、抗生素的产生以及生物发光有关，被越来越多的细菌用于强化它们与其他细菌、真菌、植物和动物的生存竞争[3～5]。考虑到许多细菌都为动植物病原菌，且利用群体感应来调节自身生理过程增强其竞争力，因此，靶向干扰这种种内间细菌交流的模式对医学、环境、农业都有着重要的意义，它已成为微生物研究的一大热点。

研究发现，N-酰高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）是一类广泛存在于革兰氏阴性细菌群体感应系统中的信号分子，AHLs介导的革兰氏阴性菌群体感应系统是目前备受关注并且研究最有成效的[6]。研究表明，细胞合成AHLs信号分子和AHLs合成酶的活性相关，这种酶通常由LuxI的同源基因编码，当所累积的AHLs分子浓度达到一定阈值时，就会与费氏弧菌（Vibrio fischeri）LuxR蛋白同源转录调控子相互作用[3]，这些调控子便可调控微生物的许多生理行为，如可诱导调控胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）、费氏弧菌（Vibrio fischeri）和铜绿假单胞（Pseudomonas aeruginosa）等许多病原菌致病基因的表达[1]，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒接合转移[1]，以及伯克氏菌（Burkholderia）的群集和蹭行运动、脂肪酶的产生、β-溶血作用、碳代谢等[7]。同时，它还能够调控其他多种不同的生物功能，如毒力因子、抗生素、二级代谢物的产生、生物膜的形成、生成孢子以及生物发光等[3，8]。

研究发现，在大部分芽孢杆菌中存在的AiiA蛋白，能够使AHLs的内酯环断裂导致其失活，从而破坏革兰氏阴性细菌的群体感应系统，减弱动植物病原菌的致病性[9]。近年来，越来越多的研究报道了芽孢杆菌属中分布有AiiA蛋白。因此，本文介绍了aiiA基因和AiiA蛋白的研究现状，aiiA基因在植物抗病方面的进展和转aiiA基因植物方面的应用现况，以及AiiA蛋白在工业发展中的应用现状，为进一步研究aiiA基因奠定基础。

1 aiiA基因和AiiA蛋白的研究

1.1 aiiA基因的克隆

从2000年Dong等[9]首次从芽孢杆菌240B1克隆了一种新的内酯酶基因aiiA之后，国内外对aiiA基因越来越关注，接着Dong等[10]又从不同来源的菌株中获得了9个具有AHLs内酯酶功能的基因，并对其基因序列进行分析，结果表明这些基因和aiiA240B1属于同一个N-酰基高丝氨酸内酯酶家族。2004年，周燚等[11]根据蜡状芽孢杆菌中的aiiA基因序列设计引物，从筛选得到的具有较强抗软腐病活性的苏云金芽孢杆菌H38中成功扩增出aiiA基因。河北工业大学的王艳敏[12]以马铃薯为材料，发现芽孢杆菌Bt4和苏云金芽孢杆菌山东亚种ACCC10314能有效地抑制病原菌对马铃薯的侵染，证明这2种菌中含有水解AHLs的水解酶。根据文献发表的基因序列设计特异性引物，从这2个菌株中克隆出了aiiA基因。

为了更好地研究aiiA基因的功能，黄天培等[13～15]分别从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt），蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus，Bc）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，Bs）中成功克隆出了aiiA基因。近十几年来许多研究也均能从Bt、Bc及Bs中克隆出aiiA基因，并在不同表达系统中表达具有高活性的AiiA蛋白。2013年丁贤等[16]根据细菌群体感应信号降解酶（AiiA）基因设计简并引物，从海洋微生物ZD02基因组中扩增编码AiiA的基因aiiA，筛选其阳性克隆，测序后并对其进行序列分析。以上研究为该序列的重组表达及其相关活性研究奠定了基础。

在国内外学者的不断探索下，最近对aiiA基因的来源有新的发现。Khoiri等[17]从31株细菌中分离出4株抗兰花软腐病致病菌Dickeya dadantii的细菌B37、BT2、GG3、GG6，通过对其16s rRNA进行序列分析，结果表明这些细菌和短小芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌ATCC14579和苏云金芽孢杆菌ATCC10792有很高的相似性，这是首次以短小芽孢杆菌作为群体淬灭细菌进行报道。

1.2 aiiA基因和AiiA蛋白的生物信息学分析

随着生物信息学的发展，许多研究人员利用生物信息学的工具对aiiA基因的序列和AiiA蛋白的结构进行分析，结果发现aiiA基因有753个碱基，序列具有高度保守性和同源性[18]，与GeneBank上登陆的aiiA基因经序列比对，相似度均在80%以上[19]。

AiiA蛋白含有250个氨基酸残基，推测其分子量为28 kDa左右，等电点为4～5，含有金属-β-内酰胺酶超家族和锌依赖的水解酶及乙二醛酶这2个结构域[18]。该酶的氨基酸序列存在比较保守的区域，即HXHXDH基序，为含锌水解酶家族的成员。在AHL水解酶中，His119、His188、His210组成催化活性中心。通过定点突变试验，发现蛋白序列中保守区域和组氨酸残基都是维持AiiA蛋白活性所必需的[9，12]。

2005年Liu等[20]利用单波长反常散射法测出了苏云金芽孢杆菌AHL内酯酶即AiiA蛋白的三维结构，该研究表明该酶是金属-β-内酰胺酶家族的成员，并且在它的活性中心有2个锌离子，这些锌离子起着调控许多配体的作用，被认为是将AHLs水解为开环产物的亲核试剂，能够破坏革兰氏阴性细菌的群体感应。了解AiiA蛋白的详细结构和作用的机制，有助于我们研究出更有效的生物防治的方法，为解决依赖群体感应系统的病害的消除提供一条新思路。

2 aiiA基因在抗病方面的进展

大部分动植物致病菌都为革兰氏阴性细菌，利用群体感应进行侵害[21]。当其自身分泌的信号分子增加到临界值时，细菌就会启动自身致病基因的表达，从而达到使动植物致病的目的。例如主要由欧文氏菌（Erwinia）导致的马铃薯、兰花、甜菜、玉米、胡萝卜、芹菜、洋葱等多种植物的软腐病[10，22]，它能够使正在生长以及储存运输中的植物发生腐烂；伯克氏菌（Burkholderia）群体感应引起的羊红细胞的β-溶血作用[7]；哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）导致的养殖对虾和鱼类的发炎充血症状[23]；以及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）引起的呼吸道感染、败血症、骨髓炎、心内膜炎和尿路感染等疾病[24]等。因此，寻找一条有效解决革兰氏阴性致病菌群体感应的途径对动植物抗病来说非常有必要。近几十年科研结果表明，AiiA蛋白对降解AHLs信号分子有着显著的作用，所以，可以从aiiA基因着手，通过构建工程菌以及转基因动植物来抵抗病原菌的群体感应。

2.1 构建工程菌提高AiiA蛋白的活性

在aiiA基因的发现以及群体感应系统研究更为深入之后，近年来许多研究将目标转向了寻找可以高效表达AiiA蛋白的表达系统，其中包括大肠杆菌、芽孢杆菌及酵母等表达系统。为了提高AiiA蛋白的活性，周燚等[11]从Bt中克隆出aiiA基因，并利用大肠杆菌表达载体PET-28a在BL21（DE3）中进行表达，获得大量的包涵体蛋白，致病性检测纯化的AiiA蛋白对魔芋软腐病菌CZY具有较强的致病活性。杨梅等[25]克隆了6株来源不同的苏云金芽孢杆菌中的aiiA基因，并将aiiA-B15基因插入到大肠杆菌表达载体，构建重组质粒转入大肠杆菌中表达，经诱导剂诱导后得到大量的融合蛋白，并对表达条件进行优化，结果表明，0.6 mmol/L IPTG，30℃下诱导3 h为最佳诱导条件。致病性检测表明，该融合蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌具有较强的抗病作用。由于所表达的融合蛋白多为不可溶的包涵体，杨梅等[26]又经过分离、变性溶解、复性获得具有生物活性的蛋白质，抑菌试验证明，复性后的AiiA蛋白能够有效抑制胡萝卜欧文氏菌引起的马铃薯软腐病。此外，杨梅等[27]还将苏云金芽孢杆菌LLB15中aiiA基因克隆到pET-29a，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，经过低温IPTG诱导，获得大量的可溶性蛋白，并在国内外首次纯化了带6-His标记的AiiA蛋白。

研究表明，芽孢杆菌中的AiiA蛋白为一种胞内蛋白，不能分泌到细胞外直接降解环境中的AHLs信号分子，且表达量低，因此构建外源高效分泌表达AiiA蛋白的工程菌是一条有效的解决途径。朱晨光等[28]利用重叠延伸PCR，用杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子替换aiiA基因本身的启动子，构建了融合基因pro3A-aiiA并装入穿梭载体pHT304，得到重组质粒并转化Bt无晶体突变株BMB171，结果重组菌株AiiA蛋白表达量大幅度增加，并且对降解AHLs和抑制胡萝卜欧文氏菌感染马铃薯的能力也明显增强。这一研究成功将AiiA蛋白分泌到胞外，解决了AiiA蛋白表达和降解信号分子AHLs的局限性，大大提高了对病原菌的抑制作用。吴怀光等[29]为了进一步提高抗软腐病工程菌的抗病活性，除了用杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量外，还利用苏云金芽孢杆菌s-层表面展示系统构建了融合基因slhaiiA，将2个融合pro3A-aiiA和slh-aiiA基因单独或同时装入穿梭载体中，转化苏云金芽孢杆菌无晶体突变株BMB171，同时利用温度敏感型辅助质粒pEG922，在Bt体内发生同源重组，消除抗性基因等非必需片段，减少质粒的压力。结果获得的3个重组菌都能在Bt中稳定高效地表达AiiA蛋白，其降解AHLs分子的能力和对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制作用都有所增强，且同时装入2个融合基因AiiA蛋白的表达量和活性最高。这种同时将2个融合基因装入同一表达载体的方法，对我们提高蛋白的表达量及活性有着重要的启示，为基因工程操作提供了一种新方法。

此外，国内外学者为了获得高效的生防效果，纷纷将aiiA基因转入荧光假单胞菌中表达AiiA蛋白。2003年，Molina等[30]把aiiA基因转入生防效果不显著的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）P3中，构建了能够降解AHLs的生物防治菌株，转化株P3/pME6863能够显著地减弱由胡萝卜欧文氏菌导致的马铃薯腐烂以及土壤农杆菌导致的番茄冠瘿病。张霞等[31]将aiiA基因导入到植物根际促生荧光假单胞菌P303中，构建了防治效果良好的植物工程菌，其能在一定程度上抑制马铃薯和大白菜的软腐病。

娄瑞娟等[32]将aiiA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K，转化毕赤酵母GS115，经一系列筛选过后获得高拷贝表达盒的酵母转化子，诱导表达后经RT-PCR可检测到重组菌中编码aiiA基因的mRNA，同时SDS-PAGE和Western blot检测结果显示，aiiA基因在毕赤酵母中成功表达，以紫色杆菌突变株CV026为指示菌检测发现目的蛋白能够降解N-酰基高丝氨酸内酯。

为了提高AiiA的表达量，近年来许多研究利用在不同表达系统中密码子的偏好性，通过优化aiiA基因密码子的方式来实现。

曾世涌等[33]对苏云金芽孢杆菌中aiiA基因的密码子使用情况进行分析，比较了aiiA基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌以及毕赤酵母中的密码子偏好性。结果表明，aiiA基因偏好使用以A、T结尾的密码子，且aiiA基因的密码子用法在这几种菌中都有不同程度的偏好差异，其中与毕赤酵母的密码子用法差异最大；比较了aiiA基因分别以这几种菌为宿主时密码子的使用频率，发现都存在不同程度的低频密码子聚集现象，这为以后在上述几种表达系统中实现aiiA基因的高效表达提供了新思路。2014年，简思美等[34]利用定点突变技术，对aiiA基因进行密码子优化，在毕赤酵母中进行分泌表达，抗病性实验分析结果表明，分泌表达的AiiA蛋白能有效抑制胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）的致病性；之后，简思美等[35]基于毕赤酵母基因组偏好密码子数据表对编码AiiA蛋白的碱基序列进行密码子优化，并构建多拷贝重组表达载体，成功表达出具有活性的AiiA蛋白。试验结果表明，优化后aiiA基因的表达量较优化前的表达量有成倍地提高，但优化后的多拷贝表达量增加并不明显，结果表明优化密码子可以有效提高AiiA蛋白在毕赤酵母中的表达量，但是多拷贝表达载体对AiiA的表达促进作用并不显著，提示未来探索AiiA蛋白在毕赤酵母中的高表达时，通过增加拷贝数来提高产量并不是一个很好的途径，而进行密码子的优化可以有效提高产量。此外，AiiA蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，拓宽了AiiA蛋白的获取途径，为AiiA蛋白的产业化提供理论依据。

2.2 转aiiA基因植物的抗病研究

相比较传统的昂贵且对环境不利的化学抗病方法，转基因技术对于植物抗病研究也是一种有效的应对群体感应系统的途径。2001年，Dong等[36]将aiiA基因转入马铃薯和烟草花叶中后，这2种转基因植物表达的AHL内酯酶能够淬灭群体感应的信号分子，并且提高对胡萝卜软腐欧文氏菌的抗性。柴鑫莉等[37]和Ban等[38]分别将苏云金芽孢杆菌的aiiA基因的密码子进行优化后，利用农杆菌介导的转化法将人工合成优化后的aiiA基因导入花魔芋中，AHLs酶活性检测表明转aiiA魔芋叶片的蛋白可以降解AHLs信号分子。且有相关研究证明，aiiA基因在转基因魔芋中是稳定和可遗传的[39]。陈磊等[40]利用PCR技术从马铃薯块茎基因组DNA中克隆块茎特异性启动子patatin，从苏云金芽孢杆菌218中克隆aiiA基因，构建抗软腐病植物表达载体pBI121-patatin-aiiA，并利用农杆菌介导法将aiiA基因导入花魔芋，结果表明，转化后的植株经GUS染色，仅在花魔芋的球茎部位出现蓝色斑点，经PCR检测，RT-PCR及Southern杂交检测证实aiiA基因已整合到花魔芋基因组，初步表明aiiA基因可在魔芋球茎内特异性表达。本研究对今后魔芋通过分子遗传工程改良软腐病抗性具有一定的应用价值。

细菌软腐病也是石斛兰及其他兰花栽培和生产中的一大病害。潘丽晶等[41]从Bt菌中克隆出aiiA基因，并装载入植物表达载体构建出pSAN载体转入石斛兰中，获得了转aiiA基因植株，肖扬[42]将aiiA基因和抗菌肽hacD基因的成熟肽片段融合插入到一个双元转化载体中，构建了高效植物表达载体pC-AH。利用农杆菌介导的转化法转化石斛兰，经过PCR、Southern blot分析，从13株获得的抗性转基因苗中确定了3株抗性苗的基因组中已整合了融合基因aiiA-hacD。这些研究为获得具有抗软腐病的石斛兰品种打下基础。

尾巨桉是尾叶桉与巨桉杂交种，树高40m以上用途广泛，但随着桉树林的扩大，病虫侵害这一问题已逐渐成为桉树种植的一大障碍。为了提高其抗病害的能力，Ouyang等[43]从枯草芽孢杆菌中克隆aiiA基因，构建植物表达载体Pcam-PPP3-aiiA，利用农杆菌转化法导入尾巨桉中进行表达，RT-PCR检验表明aiiA基因成功导入巨尾桉，致病性检测结果表明转aiiA基因植物较非转基因而言，能够延迟萎蔫和降低疾病的病情指数。这些试验表明，aiiA基因在转基因植物中的表达水平很高，足以减弱病原菌的生长以及疾病的发展，也意味着这种方法可以应用于其他农作物，以达到增强抵抗植物病原菌能力的目的。

除了利用农杆菌转化法获得转aiiA植物，我国学者还尝试了几种其他将外源基因导入植物的方法。例如韩丽伟[44]利用花粉管道法将aiiA基因转入大白菜二牛心品种中获得转aiiA基因大白菜；张言朝等[45]用子房注射法对南瓜子房进行aiiA基因的遗传转化等，这些研究表明，基因操作技术的进步为转基因植物的发展奠定了坚实的技术基础，有利于我们获得更有益的转基因植物及食品。

3 AiiA蛋白在酶的工业化方面的进展

AiiA蛋白是一种非常好的用于发展生物净化药物的材料，它能够破坏工业和环境微生物的群体感应系统，但对于AiiA的商业化生产来说，有几个局限，包括酶生产的高成本和缺少从应用环境中回收再利用的方法。对于高成本的问题，可以通过相同成本使产量最大化。Rajesh等[46]利用响应优面化（RSM）及中心合成设计软件优化植物内生菌产气肠杆菌培养条件，以C6-HSL为底物，和内生植物病菌的上清液共培养，以紫色杆菌CV026作指示菌，设计不同培养温度，共培养时间，底物浓度及pH值来检验AHL内酯酶的产量以及相对活性，活性检测结果表明，植物内生菌产气肠杆菌能够有效地抑制紫色杆菌素的产生，且优化培养条件后增加了1.33倍的相对活性；二次回归模型的方差数据分析表明RSM模型非常可靠，有着较高的回归系数以及低的变异系数。由此可见，优化培养条件的策略对于酶的最大产生是一种非常有价值的手段。

AiiA蛋白商业化的另一个局限性是从环境中回收再利用，也有一些专家做过一些尝试。Beladiya等[47]克隆、纯化了重组的AiiA蛋白（r-AiiA），将其共价固定在磁性纳米粒子（MNPs）上，并且在水溶液中对r-AiiA-MNPs纳米生物催化剂群体感应淬灭的能力进行检测，结果表明它能够水解3-O-C10AHL以及在水溶液中抑制群体感应，并且利用外部磁场能够将其从反应混合物中再生，且多次再生的r-AiiA-MNPs仍能够水解3-O-C10AHL。

4 研究目的、意义及前景展望

随着对AHLs信号分子调控的群体感应系统（QS）研究的深入，细菌的AiiA蛋白在抑制许多病原菌中发挥越来越重要的作用，已经成为解决利用群体感应细菌病害的新方法，但其中仍有许多机制和过程不太清楚，有待进一步研究和探索。例如，如何让来源于芽孢杆菌的aiiA在外源表达系统中高效表达，并且有抑菌活性；来源不同的aiiA基因，降解AHLs的效果差异很大的原因以及AiiA蛋白在细胞生长过程中何时发挥作用。此外，对于农业和工业来说，AiiA蛋白的酶活力、热稳定性和存储稳定性极其重要。因此，发现新的aiiA基因，研究细菌群体感应系统的调控机理，不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的实践价值。目前研究aiiA基因的表达系统多集中在大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、酵母等微生物中，除此之外，枯草芽孢杆菌也是当下研究和应用十分广泛的微生物杀菌剂之一，其菌种资源十分丰富，能够分泌抑菌物质和多种抗菌多肽，广泛应用于医药和农业行业。因此，在芽孢杆菌中表达aiiA基因，产生高效的AiiA蛋白，对构建植物生防菌有着重要的启示。另外，构建转基因植物也是预防病原菌的一条重要的途径，所以我们要深入研究AiiA蛋白的作用机制，利用基因工程的工具，为构建更高效、广谱的杀菌剂或杀虫剂奠定基础。

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Research Progress onaiiAGene in Resistance to Disease from Bacillus Species

CHEN Junjun1,MIN Yong2,LIU Xiaoyan2,YANG Ziwen1,2

(1.Wuhan University College of Life Sciences,430061;2.National Biopesticide Engineering Research Center,Hubei Academy of Agricultural)

AiiA protein encoded by aiiA gene is a kind of acyl-homoserine lactonase produced by Bacillus species thatcan exclusively hydrolyse the AHLs signal molecules secreted by gram negative bacteria that destroy pathogenicmechanism which depend on the quorum sensing system and reduce the pathogenicity of the pathogen. The essaycomprehensively analyzed the research situations of aiiA and AiiA, the current research progress of aiiA in disease -resistant and the application status of AiiA protein in industrial development, which can provide aiiA gene with theoreticalbasis on more fields of application.

Bacillusspecies;Quorum sensing;aiiAgene;N-acylhomoserine lactones(AHLs)

杨自文 博士，湖北省农业科学院研究员、首席专家，武汉大学博士生导师。国家生物农药工程技术研究中心主任，中国生物农药与生物防治产业技术创新战略联盟副理事长，湖北省人大常委会委员。国家“863”计划“农业药物”领域专家，国家“百千万人才工程”第一、二层次人选，享受国务院特殊津贴，荣获全国优秀农业科技工作者、湖北省劳动模范称号。

Q344+.13

A

1001-3547（2017）20-0036-07

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.20.015

湖北省农科院竞争性项目（2015jzxjh04）；国家自然科学基金青年基金项目（31500428）；湖北省创新中心项目（2016-620-000-001-038）；湖北省农科院重大研发成果培育专项（2017CGPY01）

陈珺君（1993-），女，硕士，专业方向为微生物学，E-mail：2015202040050@whu.edu.cn

刘晓艳（1979-），女，通讯作者，博士，副研究员，专业方向为土传性病害生物防治，E-mail：xiaoyanliu6613@163.com

杨自文（1962-），男，通讯作者，博士，研究员，专业方向为生物农药创制，E-mail：ziwen.yang@nberc.com

2017-06-07