吡格列酮对糖尿病大鼠视网膜早期病变的影响及其机制研究

杨主敏，王 鲜，徐 涛，潘学良，陆德琴 （贵州医科大学附属医院：眼科，病理科，贵州 贵阳 550004）

吡格列酮对糖尿病大鼠视网膜早期病变的影响及其机制研究

杨主敏1，王 鲜1，徐 涛1，潘学良1，陆德琴2（贵州医科大学附属医院：1眼科，2病理科，贵州 贵阳 550004）

目的：探讨吡格列酮对早期糖尿病大鼠视网膜丝氨酸／苏氨酸激酶（Akt）的表达及微血管病变的影响．方法：雄性SD大鼠共58只，取18只作为非糖尿病模型组，其余采用链脲佐菌素（STZ）诱导大鼠糖尿病模型，去除未成模及死亡的大鼠4只，将糖尿病模型组大鼠随机分为糖尿病组（n＝18）及治疗组（n＝18）．治疗组在建模后第3天开始给予吡格列酮灌胃（10 mg／kg，隔日一次），非糖尿病模型组和糖尿病模型组大鼠则在同时间给予等量的生理盐水灌胃，所有大鼠每周监测血糖及体质量．给药后4周、8周末进行大鼠视网膜铺片观察、免疫组织化学法检测 p-Akt（Ser473）、p-Akt（Thr308）及总Akt蛋白的阳性单位及分布．结果：免疫组织化学结果显示，相比非糖尿病组，糖尿病组视网膜中的Akt、p-Akt（Ser473）及p-Akt（Thr308）表达降低，差异有统计学意义（P＜0．05）．治疗组 Akt、p-Akt（Ser473）及 p-Akt（Thr308）阳性反应表达较糖尿病组增加，差异有统计学意义（P＜0．05）．ADP酶染色法显示：4周时各组间视网膜血管无明显变化，均未见明显周边部毛细血管扭结、迂曲或形成血管闭塞及血管袢现象；8周时，糖尿病组和治疗组均可看见视网膜周边部毛细血管有扭结、迂曲，但治疗组该现象较对照组减轻．结论：吡格列酮能明显激活实验性糖尿病大鼠Akt蛋白及其磷酸化位点，从而缓解糖尿病大鼠的视网膜早期病变．

糖尿病视网膜病变；Akt；p-Akt；吡格列酮

0 引言

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）作为糖尿病的眼部并发症已严重影响人类的健康．研究［1-3］表明，糖尿病血管病变的主要原因是血管内皮细胞功能异常．其中PI3K／AKt信号通路在糖尿病血管内皮炎症、凋亡、增殖的调控中起关键作用［4-6］．吡格列酮是噻唑烷二酮类抗糖尿病药物，是过氧化物酶增殖物激活受体 γ（peroxisome proliforator-activated receptor γ， PPAR-γ）激动剂，增加依赖胰岛素的葡萄糖的处理．但是否通过影响PI3K／AKt信号通路，从而能改善血管内皮细胞功能却少有报道．本研究旨在观察吡格列酮对糖尿病大鼠视网膜Akt蛋白表达及其磷酸化的变化，以及能否缓解早期糖尿病视网膜微血管病变，探讨其意义和可能的机制．

1 材料和方法

1．1 材料 选取同一批繁殖的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（重庆腾鑫实验动物中心提供）共58只，体质量（200±20）g．在贵州医科大学病理生理教研室饲养区饲养，整个过程中以标准颗粒饲料喂养，不限食水．适应性喂养一周后，随机取18只作为非糖尿病大鼠模型，40只作为造模组．将链脲佐菌素（streptozotocin， STZ， Sigma 公司）以 0．1 mol／L，pH4．5 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成1%溶液，按50 mg／kg体质量一次性由鼠尾静脉注射，建立糖尿病模型，非糖尿病模型作为空白对照，方法为将大鼠鼠尾静脉则注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液．给药72 h后，用罗氏血糖仪（美国堡灵曼公司）取鼠尾静脉血检测血糖，血糖值超过17．6 mmol／L即认为成功建立糖尿病鼠模型，未成模及死亡大鼠4只．

1．2 方法 将糖尿病模型大鼠随机分成为糖尿病组（n＝18，DM 组）和治疗组（n＝18，PIO 组），PIO 组给予吡格列酮灌胃（10 mg／kg，隔日一次，连续 8周）．给药后4周末及8周末，用腹腔注射水合氯醛麻醉后经股动脉放血处死各组大鼠并取材．取出各组大鼠双眼眼球，左眼用于免疫组织化学测定，右眼用于视网膜酶组织化学染色铺片．

1．2．1 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学（strept avidin-biotin complex，SABC）法，多克隆抗体（santa公司）．制备视网膜石蜡切片，切片厚度为5 μm．将组织在室温中放置60 min后，经二甲苯脱蜡和乙醇逐级水化后，再对组织抗原进行高温热修复；冷却至常温后，用自来水冲洗5 min，加3%过氧化氢恒温箱孵育以阻断内源性过氧化物酶；磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，各5 min；加非免疫性动物血清封闭液，20 min后甩去多余液体，滴加一抗4℃过夜；PBS洗5 min共3次，滴加生物素化二抗，室温下30 min；PBS洗3次，各2 min，然后DAB显色，自来水冲洗5 min，苏木素复染，逐级脱水、透明、封片、镜检．有阳性表达的 Akt蛋白、Akt（Ser473）和 Akt（Thr308）的细胞质均呈现棕黄色或黄褐色颗粒．

1．2．2 视网膜血管铺片 大鼠眼球经4%多聚甲醛固定24 h后取出，将眼球沿锯齿缘剪开，除去角膜、晶状体，再以视乳头为中心，沿4个方向作放射状切开，除去巩膜、脉络膜，在培养皿中放置一张浸湿滤纸，将视网膜平铺于上面，用毛笔刷去玻璃体及后面的色素，直至半透明状的视网膜．按照ADP酶染色法对视网膜进行染色：①将视网膜铺片用Tris-马来酸缓冲液（0．05 M，pH 为 7．2）冲洗 15 min，共 5 次．②于 37℃反应液（浓度为 0．2 M，pH 为 7．2的 Tris-马来酸缓冲液中加入3 mol／L硝酸铅、6 mol／L氯化镁、1 mg／mL ADP）中反应 15 min．③Tris-马来酸缓冲液（0．05 M， pH 为 7．2）冲洗 15 min，共 5 次．④用 10%硫化铵显色 5 min．⑤Tris-马来酸缓冲液（0．05 M，pH为7．2）冲洗15 min，共 5次．⑥甘油明胶封片，显微镜下观察．

1．3 图像处理 大鼠视网膜切片经过免疫组织化学染色，在光学显微镜下观察，有阳性表达的Akt蛋白、Akt（Ser473）和 Akt（Thr308）的细胞质均呈现棕黄色或黄褐色颗粒．将每组大鼠视网膜随机取18张切片，每张切片在400×显微镜视野下随机观察5个视野，利用分析软件（武汉千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色病理图片报告分析系统）测定视野中阳性单位值．

1．4 统计学处理 采用SPSS18．0统计学软件对数据进行分析．计量资料以±s表示，多组均数比较采用One-Way ANOVA分析，多个样本均数间两两比较通过Student-Newman-Keuls分析；两组均数比较采用两独立样本t检验，P＜0．05表示差异有统计学意义．

2 结果

2．1 各组大鼠的血糖及体质量变化 实验期间（给药后4周、8周），糖尿病组大鼠和治疗组大鼠血糖显著高于同时间点的非糖尿病组（P＜0．05，表 1），而体质量明显低于同时间点的非糖尿病组（P＜0．05，表 2）．

表 1 各组大鼠血糖检测结果 （n＝9，mmol／L，±s）

表 1 各组大鼠血糖检测结果 （n＝9，mmol／L，±s）

aP＜0．05 vs非糖尿病组．

分组 0周 4周 8周非糖尿病组 5．89±1．14 6．00±0．71 5．52±0．53糖尿病组 5．51±0．88 28．90±2．17a 25．51±3．60a治疗组 5．51±0．55 26．97±3．19a 27．71±4．23a

表2 各组大鼠体质量检测结果 （n＝9，g，±s）

表2 各组大鼠体质量检测结果 （n＝9，g，±s）

aP＜0．05 vs非糖尿病组．

分组 0周 4周 8周非糖尿病组 195．58±20．48 297．87±14．09 402．73±27．07糖尿病组 201．78±24．86 126．50±18．11a 126．44±12．98a治疗组 201．81±21．37 155．84±14．63a 148．97±19．12a

2．2 各组大鼠视网膜上 Akt蛋白、Akt（Ser473）及Akt（Thr308）蛋白的表达 光镜观察：在给药后4周、8周两个时间点，非糖尿病组大鼠视网膜可见大量的Akt及p-Akt表达，呈阳性棕黄色反应，在内核层和节细胞层表现最显著．在糖尿病组大鼠视网膜中，4周时可见较弱的Akt及p-Akt表达，8周的阳性表达尤其微弱．治疗组Akt及p-Akt的阳性反应程度及范围均较同期糖尿病组明显增多（图1）．

图1 4周大鼠视网膜Akt的表达（DAB显色，×400）

2．3 计算机图像定量分析 同一时间点中，糖尿病组大鼠视网膜 Akt蛋白、Akt（Ser473）及 Akt（Thr308）的阳性单位较非糖尿病组明显减少，差异有统计学意义（P＜0．05）．治疗组大鼠视网膜 Akt蛋白、Akt（Ser473）及 Akt（Thr308）的阳性反应面积较糖尿病组明显增加，差异有统计学意义（P＜0．05，表 3）．

2．4 ADP酶组织化学结果 ADP酶组织化学显示：给药4周时，非糖尿病组大鼠视网膜血管自视盘发出动静脉向四周呈放射状分布，周边毛细血管分布均匀；糖尿病组和治疗组大鼠视网膜与非糖尿病组比，其血管形状、分布、走形等均无明显变化．给药在8周时，糖尿病组和治疗组大鼠可见视网膜血管无灌注区及周边部毛细血管迂曲、扭结及血管闭塞现象，并且糖尿病组该现象比治疗组明显（图2）．

表3 免疫组化检测各组大鼠视网膜Akt、Akt-Ser473及Akt-Thr308蛋白的表达 （n＝9，±s）

表3 免疫组化检测各组大鼠视网膜Akt、Akt-Ser473及Akt-Thr308蛋白的表达 （n＝9，±s）

aP＜0．05 vs非糖尿病组；cP＜0．05 vs糖尿病组．

4周分组8周Akt Akt（Ser473） Akt（Thr308）Akt Akt（Ser473） Akt（Thr308）非糖尿病组 20．07±0．60 19．49±0．56 20．20±0．35 19．73±0．64 19．58±0．62 20．06±0．33糖尿病组 9．23±0．63a 9．72±0．70a 9．95±0．44a 7．37±0．39a 8．30±0．46a 7．65±0．40a治疗组 14．36±0．53c 14．97±0．36c 14．84±0．45c 13．85±0．54c 14．82±0．33c 14．78±0．42c

图2 8周各组ADP酶组织化学结果

3 讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病的眼部并发症，该病的发生率随着糖尿病病程的延长而增高，并且是导致失明的重要原因之一．DR的发病机制尚不清楚，目前经典理论认为DR最基本的病理改变是微血管改变［7-9］，而内皮细胞是微血管的一道屏障．研究表明高糖条件下产生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可使Akt去磷酸化，促进内皮细胞凋亡，PI3K／Akt的特异性抑制剂LY294002以剂量依赖性方式削弱内皮细胞的生殖，而在高糖条件下转染构建性激活的Akt突变体能增加内皮细胞的增生；高糖还能抑制PKB激活或加速PKB灭活，进而抑制其下游eNOS的产生而加速内皮细胞凋亡［10］．研究［11］表明，PI3K／Akt途径参与抑制炎症反应，激活Akt可发挥部分抗炎作用，保护受损的内皮细胞，Akt去活化诱导血管黏附分子-1（vascular adhesion molecule 1， VCAM-1）的表达，诱导炎症效应，促进血管内皮细胞的损伤．

吡格列酮是噻唑烷二酮类抗糖尿病药，已广泛用于临床．在体内能通过激活PPARγ受体而发挥其生物学作用．PPARγ在多种组织均有低水平的表达，在血管平滑肌和内皮细胞也有表达［12-13］．PPARγ的激活不仅能改善胰岛素敏感性，降低血糖，还能通过增强eNOS-Serll79、1177的磷酸化及eNOS与热休克蛋白90的相互作用而刺激NO的释放，对血管内皮产生保护作用［14-15］．然而，吡格列酮是否通过激活PI3K／Akt途径，从而缓解糖尿病视网膜的微血管病变，目前尚未见报道．本研究发现，用STZ诱导的早期糖尿病大鼠视网膜中Akt蛋白、Akt（Ser473）及Akt（Thr308）表达均较非糖尿病组明显降低，并在8周时可见视网膜周边部毛细血管迂曲、扭结及血管闭塞现象．而用吡格列酮治疗组，大鼠视网膜Akt蛋白和其磷酸化位点Ser473、Thr308表达均较糖尿病组升高，且8周时视网膜毛细血管迂曲、扭结及血管闭塞现象较糖尿病组程度轻．提示我们糖尿病视网膜血管的早期病变可能与抑制PI3K／Akt通路有关．

综上所述，吡格列酮作为噻唑烷二酮类抗糖尿病药物在控制血糖的同时也可通过激活PI3K／Akt通路保护视网膜微血管病变，这将有可能为糖尿病视网膜病变的发病机制及治疗方法的选择等提供一些新的思路．

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Effect of pioglitazone on early retinopathy of diabetic rats and its mechanism

YANG Zhu-Min1， WANG Xian1， XU Tao1， PAN Xue-Liang1， LU De-Qin21Department of Ophthalmology，2Department of Pathology， Affiliated Hospital of GuiZhou Medical University， Guiyang 550004，China

AIM： To investigate the effect of pioglitazone on the expression of serine／threonine kinase （Akt） and microvascular diseases in early diabetic rats．METHODS： A total of 58 male SD rats were selected as the objects of study．Eighteen rats were selected as normal control group．The diabetic rat models induced by streptozotocin （STZ） were randomly divided into diabetes group（9 rats×2） and pioglitazone treatment group（9 rats×2），and 4 unpaired model or death rats were removed．The rats in the treatment group were gavaged with pioglitazone （10 mg／kg， every other day） on the 3rd day after modeling．The normal control group and diabetic rats were treated with equal saline at the same time．The blood glcouse and body weight of all the rats were measured weekly．The retinas were spreaded and the expression of Akt， p-Akt（Ser473）， p-Akt（Thr308）in the retinas were detected by immunohistochemistry four weeks and eight weeks after treatment． RESULTS： Immunohistochemicalanalysisresults showed that the expression of Akt， p-Akt（Ser473） and p-Akt（Thr308） in the retinas of diabetes group were significantly lower than those of non-diabetic group，with statistically significant differences（P＜0．05）； the positive expression of Akt， p-Akt（Ser473） and p-Akt（Thr308） in pioglitazone treatment group were significantly increased than those of diabetes group，with statistically significant differences （P＜0．05）．ADP enzyme histochemical method displayed that there were no significant changes in retinal blood vessels between these two tested groups，there are no obvious tortuosity and kinking or vascular loops and vascular occlusion four weeks after treatment．However， the kinking and tortuosity of peripheral retinal capillary were visible both in diabetes and treatment group eight weeks after treatment，which were more obvious in treatment group than that in diabetes group．CONCLUSION：Pioglitazone can significantly active the Akt protein and its phosphorylation sites in experimental diabetic rats and relieve retinal diseases of diabetic rats at early stage．

diabetic retinopathy； Akt； p-Akt； pioglitazone

R587．2；R774．1

A

2095-6894（2017）11-48-04

2017-08-15；接受日期：2017-09-05

贵州省科学技术基金（黔科合J字［2010］2167号）

杨主敏．硕士生．研究方向：眼底疾病．

E-mail：549762141＠ qq．com

王 鲜．主任医师．研究方向：眼底疾病．

E-mail：liangliang830＠ 126．com