原花青素促进三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用机制研究

2017-12-05黄秉一徐朝军

湖南中医药大学学报 2017年11期

黄秉一，徐朝军，宋岚

（1.湖南中医药大学第一附属医院普外科，湖南长沙 410007；2.湖南中医药大学第一附属医院胸心外科，湖南长沙 410007；3.湖南中医药大学医学院生物化学与分子生物学教研室，湖南长沙 410208）

黄秉一1，徐朝军2，宋岚3*

目的研究原花青素（Procyanidins,PC）对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖及细胞凋亡的作用及其机制。方法常规培养细胞，24 h后随机分为阳性对照组、对照组和PC10、20、40、80、160、320 μg/mL组。MTT法检测细胞生长抑制率；流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot法检测FoxA1蛋白及抗凋亡蛋白bcl2、UCP2表达。结果PC各剂量组均可显著抑制抑制 MDA-MB-231 细胞增殖（P＜0.05）；PC（10-160 μg/mL）组剂量依赖性抑制 MDA-MB-231 细胞增殖（P＜0.05），PC（40-320 μg/mL）可以时间依赖性抑制细胞增殖（P＜0.05）；PC320 μg/mL 组各时间点细胞抑制率与 PC160 μg/mL 组差异无显著性（P＞0.05）； 160 μg/mL PC 可以时间依赖性促进 MDA-MB-231 细胞凋亡（P＜0.05）；160 μg/mL PC 作用 24 h 后，FoxA1 蛋白表达显著上升（P＜0.05），同时 bcl2 及 UCP2 表达降低（P＜0.05）。结论PC 抑制 MDA-MB-231 细胞，促进 MDA-MB-231 细胞凋亡，升高其FoxA1表达，同时降低bcl2及UCP2表达，表明PC可能通过促进FoxA1表达发挥促进MDA-MB-231细胞凋亡的作用。

原花青素；MDA-MB-231细胞；三阴乳腺癌；FoxA1细胞凋亡

原花青素（procyandin,PC）是自然界来源丰富的多酚类黄酮植物化合物，由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。目前在葡萄籽、荔枝壳等多种植物中含量丰富。研究发现，原花青素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、心血管保护等多种功能[1-5]。在抗肿瘤方面，近年研究显示，PC可以抑制包括前列腺癌、肺癌在内的多种癌细胞增殖，尤其对化疗药物耐受的一些肿瘤细胞株也有较好的生长抑制效应[5-7]。

FoxA1是翼状螺旋转录因子家族成员之一，在胚胎形成、细胞分化等方面具有重要的功能。研究显示FoxA1在乳腺癌的发生发展中也具有重要作用，在不同种类的乳腺癌细胞中，FoxA1表达程度不一，对导致不同种类乳腺癌细胞对雌激素敏感性以及对现在标准的激素治疗的效果及预后不同[8-10]。本实验组前期研究显示原花青素可以调节包括乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株在内的多种细胞FoxA1表达。本研究旨在本课题组前期实验基础上观察PC对雌激素不敏感型三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其是否通过FoxA1发挥作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自ATCC；胎牛血清购自杭州四季青生物材料公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；顺铂(DDP)购自江苏豪森药业股份有限公司；胰蛋白酶和MTT试剂购自Sigma公司；兔抗人FoxA1抗体购自Abcam公司；鼠抗人B淋巴细胞瘤-2（bcl2）和解偶联蛋白2（UCP2）抗体购自Abcam公司；GAPDH及相应二抗抗体、BCA试剂盒均购自武汉博士德公司。

1.2 实验分组

常规培养人三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞，取对数生长期细胞，随机分为对照组、阳性对照组（顺铂组）和 PC 组（10、20、40、80、160、320 μg/mL）。

1.3 MTT法检测PC对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用

对数生长期细胞常规消化洗涤后，以1×105/孔接种于96孔培养板，置于5%CO2、37℃二氧化碳培养箱培养24 h后，按实验分组分别加入生理盐水、顺铂、不同浓度PC。继续培养，分别于24 h、48 h、72 h后收集细胞，按照常规进行MTT实验，加入MTT后继续培养4 h，酶标仪测定各孔570 nm吸光度值（A570）。计算细胞抑制率，细胞抑制率=[（1-实验组 A570）/对照组 A570]×100%。每组设6个复孔，实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测MDA-MB-231细胞凋亡

取对数生长期细胞，按密度1×106/瓶接种于25 mL细胞培养瓶，置于二氧化碳培养箱24 h后加入PC，使其终浓度分别为160 μg/mL。并按前述实验分组设置阳性对照组（顺铂组）和对照组。继续培养48 h后弃去培养液，pH7.4 PBS漂洗细胞，70%酒精固定，-20℃孵育 2 h以上，250 g离心5 min收集细胞。细胞重悬于1 mL PBS中，室温放置10 min，250g离心5 min后细胞重悬于500 μL PBS （含 0.2%RNase A），37 ℃孵育 30 min。 4 ℃20 g/L碘化丙啶染色30 min，上机检测细胞凋亡率。

1.5 Western-blot检测相关蛋白表达

取对数生长期细胞，按密度1×106/瓶接种于25 mL细胞培养瓶，置于二氧化碳培养箱24 h后加入PC，使其终浓度分别为160 μg/mL。于预设时间点收集细胞，加入细胞裂解液，离心后收集上清，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白质与上样缓冲液混匀后煮沸 10 min。20 μg/孔上样，12%SDS-PAGE 电泳分离蛋白质，转膜后5%脱脂奶粉封闭2 h，加入相应一抗，室温孵育4 h后洗涤3次，加入相应二抗室温孵育30 min后DAB显色。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 PC对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用

实验结果显示，PC不同实验浓度组与对照组比较，MDA-MB-231细胞抑制率明显提高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PC10、20、40、80、160 μg/mL 组同一时间点不同剂量的PC作用于细胞后，随PC浓度增高，细胞生长抑制率与前一较低浓度比较亦明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；PC40、80、160、320 μg/mL组对细胞增殖的抑制作用随着时间增长而升高，具有时间依赖性（P＜0.05）；但是 320 μg/mL的PC作用于细胞后细胞各时间点细胞抑制率与160 μg/mL 组差异无统计学意义（P>0.05）。故后续实验PC浓度采用160 μg/mL展开。见表1。

表1 PC对MDA-MB231细胞增殖的影响（n=3，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；同一时间点PC组与前一低浓度比较，#P＜0.05；同一 PC 组与前一时间点比较，△P＜0.05。

组别细胞生长抑制率（%）24 h 48 h 72 h对照组PC 10 μg/mL 组PC 20 μg/mL 组PC 40 μg/mL 组PC 80 μg/mL 组PC 160 μg/mL 组PC 320 μg/mL 组顺铂组1.5±0.09 23.6±1.24*30.4±1.72*#35.3±1.66*#40.1±2.31*#44.6±1.87*#45.1±1.53*51.2±1.33*2.1±0.02 25.3±1.17*32.1±1.41*#39.6±1.38*#△45.2±2.65*#△50.1±2.50*#△51.4±1.82*△52.9±2.41*2.4±+0.02 26.8±1.45*35.2±1.27*#45.3±2.15*#△50.5±1.91*#△54.2±3.16*#△55.0±1.27*△54.8±1.73*

2.2 160 μg/mL PC对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

采用 160 μg/mL的 PC与 MDA-MB-231细胞孵育24 h、48 h和72 h后采用流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示：与对照组比较PC160 μg/mL组和顺铂组细胞凋亡率显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。随PC作用时间延长，细胞凋亡率亦上升，具有时间依赖性（P＜0.05）。见表 2。

表2 160 μg/mL PC对MDA-MB231细胞凋亡的影响（%，n=3，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与同组前一时间点比较，#P＜0.05。

组别对照组PC160 μg/mL 组顺铂组24 h 1.46±0.04 20.32±2.51*25.17±1.39*48 h 1.85±0.03 38.01±2.01*#38.95±1.26*#72 h 2.69±0.05 60.57±2.18*#65.16±1.94*#

2.3 160 μg/mL PC 对 MDA-MB-231 细胞 FoxA1、bcl2和ucp2表达的影响

采用western-blot检测MDA-MB-231细胞FoxA1、bcl2和ucp2蛋白表达。结果显示：与0 h比较，160 μg/mL的PC作用于MDA-MB-231细胞后24、48、72 h，FoxA1 表达均显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05），并且随PC作用时间延长，FoxA1表达上升具有时间依赖性（每一时间点与前一时间点比较，P＜0.05）；而 bcl2和 UCP2表达则明显下降，也具有时间依赖性，差异有显著性（与0 h比较P＜0.05，每一时间点与前一时间点比较，P＜0.05）。见图1和表3。

图 1 western-blot检测 160 μg/mL PC对 MDA-MB231细胞FoxA1、bcl2及UCP2蛋白表达的影响

表 3 160 μg/mL PC 对 MDA-MB231细胞 FoxA1、bcl2及UCP2 蛋白表达的影响（相对灰度值，n=3，±s）

注：与 0 h 比较，*P＜0.05；与前一时间点比较，#P＜0.05。

FoxA1 bcl2 UCP2 0 h 1.0±0.05 1.0±0.03 1.0±0.05 24 h 1.34±0.021*0.85±0.017*0.75±0.092*48 h 1.87±0.025*#0.56±0.008*#0.62±0.073*#72 h 2.31±0.232*#0.38±0.033*#0.58±0.054*#

3 讨论

三阴乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一种特殊的乳腺癌亚型，TNBC系雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体 (progesterone receptor，PR)和人类表皮生长因子受体一2(human epidermal growth factor receptor.2，Her.2) 表达均阴性的乳腺癌，侵袭性强、预后差，近年来受到广泛关注。我国TNBC发病率约占乳腺癌的1／4[11]。TNBC患者的5年无病生存率 (disease free survival，DFS)和总生存率 (overall survival，OS)均显著低于非TNBC患者[12]。TNBC易复发、易转移、生存率低，在临床治疗中有一定的难度。由于缺乏有效的内分泌治疗及靶向治疗，目前以蒽环类为基础的化疗为主，但疗效欠佳，容易早期局部复发和远处转移，因此寻找有效的药物治疗是目前亟待解决的问题。

研究显示，原花青素可以通过抗氧化和清除自由基、抗炎、调节NF-κB及其目标基因、促进肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞和抑制血管生成等机制起到抗癌作用。而且体内和体外肿瘤模型实验均证明原花青素对各种肿瘤均有抑制作用[5-7]。有研究显示，原花青素可以通过caspase途径促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡[13]。但是目前尚未见其对TNBC细胞株MDA-MB-231细胞凋亡的影响。

本实验结果表明实验用原花青素能显著抑制MDA-MB231细胞增殖，并促进MDA-MB-231细胞凋亡。为探讨研究原花青素诱导MDA-MB-231细胞凋亡的机制，课题组检测了FoxA1蛋白及凋亡相关蛋白的表达，结果显示原花青素作用24小时后FoxA1蛋白表达显著上升，而抗凋亡基因bcl2及UCP2表达降低。以前的研究显示FoxA1在多种肿瘤细胞中可以抑制bcl2和UCP2基因的表达[14-15]。因此推测，在MDA-MB-231细胞中原花青素可能通过升高FoxA1表达并进一步抑制bcl2和UCP2表达，从而抑制MDA-MB-231细胞增殖，促进其凋亡。详细作用机制还需要离体及在体进一步研究。

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（本文编辑匡静之）

Effect of Procyanidin in Promoting Apoptosis of MDA-MB-231 Triple-Negative Breast Cancer Cell Lines

HUANG Bingyi1,XU Zhaojun2,SONG Lan3*
（1.General Surgery,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；2.Department of Cardiothoracic Surgery,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo study the effect and mechanism of procyanidins(PC)on the proliferation and apoptosis of MDAMB-231 breast cancer cell line.MethodsThe cells were randomly divided into positive control group,control group and PC(10,20,4.,80,160,320 μg/mL)groups.Growth inhibiting rate of MDA-MB-231 cell was detected by MTT assay.Apoptosis was detected by flow cytometry,and the expression of FoxA1 protein and anti apoptotic protein (UCP2 and bcl2)were detected by Western blot.ResultsDifferent doses of PC could infinicantly inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells(P＜0.05).The inhibition rate of cell growth in the range of 10-160 μg/mL was dose-dependent(P＜0.05),and the inhibition rate of cell growth in the range of 40-320 μg/mL was time-dependent （P＜0.05).However,there was no significant between 160 μg/mL group and 320 μg/mL group in the inhibition rate of cell growth (P＞0.05).160 μg/mL PC could promote the apoptosis of MDA-MB-231 cells in the time-dependent(P＜0.05).The expression of FoxA1 protein significantly increased after 160 g/mL PC for 24 h (P＜0.05),while the expression of UCP2 and bcl2 decreased (P＜0.05).ConclusionPC could promote the apoptosis of MDA-MB-231 cells and decrease the expression of bc12 and UCP2,which may through promoting the expression of FoxA1.

procyandin;MDA-MB-231 cell;breast cancer;FoxA1;apoptosis

R286

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.007

本文引用：黄秉一，徐朝军，宋岚.原花青素促进三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用机制研究[J].湖南中医药大学学报，2017，37（11）：1196-1199.

2016-12-11

湖南省教育厅课题（13C691）。

黄秉一，男，副主任医师，主要从事乳腺及腹部外科疾病研究。

* 宋岚，女，副教授，硕士研究生导师，E-mail：344069980@qq.com。