秸秆发酵饲料高产蛋白酵母菌株分离和筛选

陆敏 兰宗宝 何立贵 赵武 姜源明 刘伟 孙建华 俸祥仁,4* 李显 何莫斌

（1，广西百朋种畜场 541502；2，广西农科院农业科技信息研究所 530001；3，广西兽医研究所 530001；4，广西南宁强微农牧科技有限公司 530001）

秸秆发酵饲料高产蛋白酵母菌株分离和筛选

陆敏1兰宗宝2何立贵1赵武3姜源明3刘伟3孙建华3俸祥仁1,4*李显1何莫斌1

（1，广西百朋种畜场 541502；2，广西农科院农业科技信息研究所 530001；3，广西兽医研究所 530001；4，广西南宁强微农牧科技有限公司 530001）

为筛选出高产蛋白酵母菌株，推进秸秆发酵饲料在畜牧业中的应用。利用培养基平板划线法从牛瘤胃食糜样本中分离筛选出高产蛋白酵母菌株，通过正交试验优化其培养条件，并依据生长曲线筛选出可作为秸秆发酵饲料用高产蛋白酵母菌。从牛瘤胃食糜样本中共分离获得10株菌落形态和细胞特征较明显的疑似酵母菌株，分别编号为x1～x10。经正交试验L16(44)优化其培养条件，发现在温度32℃、初始pH5.5、接种量12.0%、装液量100ml的条件下，各分离酵母菌的生物产量最高。在10株分离酵母菌株中，生物产量最高的4株分别是x9号、x1号、x10号和x5号。其中，x9号和x1号菌株适的应期较短，在2h后即进入对数生长期，8h后达稳定期；x10号和x5号菌株的适应期较长，4h后进入对数生长期，1 h后进入稳定期。综合酵母菌株的培养条件及生长曲线测定结果，确定假丝酵母属菌株最适宜作为秸秆发酵饲料高产蛋白酵母菌。

青贮饲料；酵母菌；生物产量；分离；筛选；正交试验

随着畜牧业和生物技术的不断发展，酵母类产品开发利用已成为饲料工业的新领域[1]。利用酵母菌发酵饲草饲料，具有成本低、原料广、周期短、产量高等优点，可提高饲料营养物质的消化率和吸收率，减少饲料原料浪费，同时缓解蛋白质饲料资源日益短缺的矛盾，促进我国畜牧业结构转型，推动畜牧业进一步发展[2,3]。青贮饲料中的微生物虽以乳酸菌为主，但酵母菌的种类和数量也不容忽视[4]。酵母菌利用青贮饲料中的糖分繁殖可增加青贮饲料的蛋白含量，同时生成乙醇等，使青贮饲料具有酒香味[5]。张秋华等[6]研究表明，采用酵母菌发酵杂粕（由豆粕、玉米脐子粕、菜籽粕和棉籽粕组成)生产菌体蛋白饲料的最佳培养基配方为接种量6%，料水比1.0∶1.4，氮源添加量3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸铵)，温度30℃，发酵周期24h，此条件下发酵终产物粗蛋白质含量57.76%，较发酵前提高48.33%。周广麟等[7]研究确定了以纤维素酶和木聚糖酶与酵母菌协同发酵葡萄皮渣生产猪饲料的最佳配比为葡萄皮渣∶豆粕∶麸皮∶玉米面=2∶2∶1∶2；酶最适条件：纤维素酶3U/g，木聚糖酶5U/g，作用温度50℃，时间72h。王雅波等[8]研究表明，采用毕赤酵母菌2.3250发酵的方法降解玉米皮中的纤维素类物质，能使其充分转化为高附加值的饲料蛋白。因此，筛选出高产蛋白酵母菌株对大力发展秸秆发酵饲料具有重要意义。本研究利用培养基平板划线法从富含酵母菌的牛瘤胃内容物中分离出酵母菌，并通过正交试验对分离菌株进行培养条件优化，为推进秸秆发酵饲料在畜牧业中的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛瘤胃食糜样本采自南宁市某屠宰场，采样后装入封口袋中密封，及时送回试验室并置于4℃冰箱中保存。麦芽汁粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、琼脂和纯净水等从市场购置，玉米秸秆粉从农户处收购，烘干粉碎。

1.2 试验方法

1.2.1 牛瘤胃食糜中酵母菌增菌培养及分离纯化

称取新鲜牛瘤胃食糜样品1.0g，均化后加入0.85%生理盐水100ml，在180r/min、30℃的恒温摇床中培养30min。然后用平板稀释法在麦芽汁琼脂培养基上接种增菌培养液，30℃培养3d，挑取单菌落进一步纯化培养2～3次，将纯化后得到的酵母菌单菌落编号接种于麦芽汁琼脂斜面上，30℃恒温培养 2～3d。

1.2.2 酵母菌生理生化鉴定

在麦芽汁粉培养基上接种纯化酵母菌菌株，30℃恒温培养48h后观察菌落特征、细胞形态及子囊孢子、菌丝、掷孢子的形成情况，并进行葡萄糖发酵试验、乙醇同化试验、KNO3同化试验和类淀粉化合物测定。

1.2.3 优化酵母菌培养条件

采用正交试验L16(44)对酵母菌培养条件（温度、初始pH、接菌量和装液量)进行4个水平检测（表1)，优化培养条件，并筛选出生长性能较好的酵母菌菌株。然后采用玉米秸秆粉培养基，在不同条件下培养48h，测定其生物量。生物量测定：取1.0ml试验生长菌液，用蒸馏水进行40倍稀释，以接种前培养基同样稀释40倍为空白，分光光度计测定660nm处的OD。

表1 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 分离酵母菌的形态特征及生理生化鉴定结果

共分离出10株菌落形态和细胞特征较明显的疑似酵母菌株，分别编号为x1～x10。在高倍显微镜下观察菌落形态和细胞特征，然后根据 《常见细菌系统鉴定手册》初步判定细菌属。

由表2和表3可看出，x1号菌株呈乳白色，无醭膜，细胞形态为卵圆形，为多端芽殖，有菌丝生成，芽殖繁殖，无掷孢子，可发酵葡萄糖，KNO3同化试验呈阳性，类淀粉物质生成和乙醇同化试验均为阴性，故初步判定为酒香酵母属。

x2号菌株呈乳白色，细胞形态为卵圆形，仅一端芽殖，有菌丝形成，芽殖繁殖，葡萄糖发酵试验、类淀粉物质生成试验和KNO3同化试验均呈阴性，乙醇同化试验呈阳性，故初步判定为瓶形酵母属。

x3号和x5号菌株的颜色均为白色，细胞形态呈圆形，多端芽殖，无菌丝生成，芽殖繁殖，葡萄糖发酵试验、类淀粉物质生成试验和乙醇同化试验均呈阴性，根据 《常见细菌系统鉴定手册》可初步判定这两株菌株为卵孢酵母属。

x4号菌株呈乳白色，细胞形态圆形，两端芽殖，有菌丝生成，芽殖繁殖，有子囊内含有1～2个帽形孢子，类淀粉物质生成试验、KNO3同化试验和乙醇同化试验均呈阳性，葡萄糖发酵试验呈阴性，故初步判定为裂芽酵母属。

x6号菌株呈乳白色，细胞形态卵圆形，多端芽殖，无菌丝生成，芽殖繁殖，有掷孢子生成并伴有锁状联合，葡萄糖发酵试验和KNO3同化试验呈阳性，类淀粉物质生成试验和乙醇同化试验呈阴性，故初步判定为锁合掷孢酵母属。

x7～x10号菌株颜色呈白色或乳白色，细胞形态圆形，有假菌丝，且可形成真菌丝，芽殖繁殖，无有性繁殖，类淀粉物质生成试验呈阴性，根据 《常见细菌系统鉴定手册》初步判定x7～x10号菌株为假丝酵母属。

2.2 培养条件优化筛选结果

正交试验L16(44)结果表明，x1～x10号菌株的最佳培养组合均为A2B1C4D3(表4)，即在温度32℃、初始pH5.5、接种量12.0%、装液量100ml的条件下，各分离酵母菌的生物产量最高。在10株分离酵母菌株中，生物产量最高的4株分别是x9号（OD660nm=1.6220)、 x1号（OD660nm=1.5765)、 x10号(OD660nm=1.5738)和x5号（OD660nm=1.5709)。

2.3 生长曲线测定结果

将优化培养筛选出的4株分离酵母菌菌株按照其最佳培养条件摇床（180r/min)培养48h，测定各菌株的生长曲线。由附图可知，x9号和x1号菌株适的应期较短，在2h后进入对数生长期，生长速度较快，8h后达稳定期；x10号和x5号菌株的适应期较长，4h后进入对数生长期，12h后进入稳定期。

3 讨论

酵母菌是单细胞真菌，具有典型的真核细胞结构，在自然界广泛存在。酵母细胞中蛋白质占细胞干重的32～75%，糖类物质占细胞干重的27～63%。酵母细胞中还富含维生素、多种消化酶和未知的生长因子，因此在食品、医疗保健、饲料、酿酒、生物工程等行业中得到广泛应用[5]。经发酵菌发酵过的饲料，含有更多的活性益生菌菌体、各种酶、各级代谢产物、多种维生素、活性小肽、氨基酸、抑菌物质等，既改善动物饲料的品质和适口性，消化吸收率明显提高，还具有维持动物肠道菌群平衡、促进动物生长、提高动物免疫力等作用[3,9,10]。但目前市场上可用于饲料发酵的酵母菌产品较少，且不同酵母菌的培养条件也不同。

表2 分离酵母菌的菌落形态和细胞形态特征

表3 分离酵母菌的生理生化鉴定结果

表4 分离酵母菌的正交试验结果

附图4 株酵母菌分离株的生长曲线

本研究利用培养基平板划线法从牛瘤胃食糜样本中分离获得10株菌落形态和细胞特征较明显的疑似酵母菌株，经正交试验L16(44)优化其培养条件，发现在温度32℃、初始pH5.5、接种量12.0%、装液量100ml的条件下，各分离酵母菌的生物产量最高，与邓露芳等[1]的研究结果基本一致。在10株分离酵母菌株中，生物产量最高的4株分别是x9号、x1号、x10号和x5号。其中，x9号和x1号菌株适的应期较短，在2h后即进入对数生长期，8h后达稳定期；x10号和x5号菌株的适应期较长，4h后进入对数生长期，12h后进入稳定期。综合酵母菌株的培养条件及生长曲线测定结果，确定假丝酵母属菌株最适宜作为青贮用高产蛋白酵母菌。

4 结论

综合酵母菌株的培养条件及生长曲线测定结果，确定x9号菌株最适宜作为秸秆发酵饲料高产蛋白酵母菌。

[1] 邓露芳,王加启,姜艳美,等.反刍动物饲用高产蛋白酵母菌株的分离和筛选 [J].中国畜牧兽医,2008,35(1)：12-15.

[2]成娟丽,张福元.生物蛋白饲料的应用[J].畜牧与饲料科学,2006(6)：49-51.

[3] 宋高杰,李瑞珍,潘耀谦,等.益生菌发酵饲料的优势及其在畜禽生产中的应用[J].中国家禽,2016,38(23)：64-67.

[4]王国仓,李增辉,范秀兰.微生物在青贮饲料中的作用[J].内蒙古畜牧科学,2003(3)：55-56.

[5]张英,王兆山,郭振环,等.酵母菌在饲料行业中的研究与应用[J].饲料与畜牧,2017(11)：46-49.

[6]张秋华,张敏.酵母菌发酵杂粕生产生物菌体蛋白饲料初探[J].中国饲料,2010(2)：32-34.

[7]周广麒,陈成,齐文茂,等.复合酶与酵母菌协同发酵葡萄皮渣生产猪饲料[J].大连工业大学学报,2014,33(1)：5-9.

[8]王雅波,刘占英,兰辉,等.酵母菌发酵玉米皮制备菌体蛋白饲料[J].中国饲料,2017(4)：31-33.

[9]李永凯,毛胜勇,朱伟云.益生菌发酵饲料研究及应用现状[J].畜牧与兽医,2009,41(3)：90-93.

[10]黄世金,俸祥仁,周勇.复合微生物发酵饲料在罗非鱼养殖中的应用研究[J].南方农业学报,2011,42(8)：1003-1006.

广西科学研究与技术开发计划项目（桂科转14125006-16)；广西创新计划专项经费项目（2015CXJHB019)；广西水产畜牧科技推广应用项目（桂渔牧科201528001，桂渔牧科201633033)；柳江县科学研究与技术开发计划项目（201606)。

陆敏（1977-），男，壮族，广西柳江县人，大专，助理畜牧师，主要从事畜牧兽医新技术的研究与推广。

*通讯作者，俸祥仁（1978-)，高级兽医师，主要从事畜牧兽医研究工作。