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极端低气压处理后低温高温交替对发状念珠藻的光合生理活性的影响

2017-12-05刘颖慧褚亚东陆洪斌曹旭鹏

载人航天 2017年6期
关键词:低气压脯氨酸气压

刘颖慧,褚亚东,陆洪斌,曹旭鹏,薛 松

(中国科学院大连化学物理研究所,大连 116023)

极端低气压处理后低温高温交替对发状念珠藻的光合生理活性的影响

刘颖慧,褚亚东,陆洪斌,曹旭鹏,薛 松∗

(中国科学院大连化学物理研究所,大连 116023)

为考察发状念珠藻在类地行星环境中生存的可行性,搭建了模拟类地行星环境的极端低气压实验装置,并研究极端低气压与低温-高温交替作用对发状念珠藻光合生理活性的影响。结果显示,在气体组成为CO2和N2(体积比为95∶5)的氛围中,在-20℃、100 Pa、600 Pa和1200 Pa气压下,分别处理发菜4天、7天、15天、30天和60天,发菜的呼吸和光合放氧速率与未处理样品没有差别。此外,不同气压下,-20℃到25℃交替处理发菜10天、20天和30天,发菜的光合及呼吸速率与正常相比也没有差异。以上结果表明,发菜能够生存在极端低气压下的低温-高温交替环境。通过分析样品的脂肪酸组成和游离脯氨酸含量发现,处理后样品的游离脯氨酸含量升高,脂肪酸组成也发生了相应的变化,这些变化是维持发菜耐受极端低气压和低温-高温交替的物质基础。

发菜;低气压;光合;呼吸;脯氨酸

1 引言

微藻在空间站上被广泛用于循环氮、水、CO2以获得有机物[1-2],其中蓝藻可以在极端恶劣环境生长[3]。发状念珠藻,俗称发菜,是一种陆生蓝藻,主要分布在干旱、半干旱地区[4]。我国是发菜分布最丰富的国家。发菜产地自然环境的特殊性及其变化节律已构成发菜赖以生存的必需条件,使得其形成了独特的生态学特性:极强的耐旱性、喜中温而耐变温、耐太阳辐射、耐盐碱、耐贫瘠、耐大风和热干风[5]。发菜的这些独特的生物特性使得发菜很有可能在类地行星环境上生存。从公开报道中看到,以德国达姆施塔特工业大学为代表的一些研究团队计划开展在火星温室中筛选藻种的工作,也有报道表明美国国家航空航天局(NASA)尝试将蓝藻应用于星际旅行和火星探索[6]。近来Fraunhofer-Gesellschaft报道两种藻属(一种绿藻和一种蓝藻)能够生活在国际空间站外面16个月[7]。然而,目前并没有微藻在类地行星环境下的极端低气压下的研究报道。

本研究通过搭建模拟类地行星环境低气压装置,利用LED光源模拟类地行星表面光照,将发菜培养在极端低气压及极端低气压处理后低温高温交替处理条件下,借助氧电极测定样品的光合放氧和呼吸速率,并通过气相色谱等分析方法测定样品的脂肪酸、脯氨酸含量变化。

2 材料和方法

2.1 实验材料

发菜采自内蒙古阿拉善盟,实验前已干燥存储2年。

2.2 极端低气压处理器搭建

为了模拟类地行星环境低气压,我们设计了如图1所示的实验装置图。通过选用高真空玻璃管,称取1 g发菜放在玻璃管中,将气体置换为95%体积的CO2和5%体积的N2后,通过真空泵抽取真空,通过压力传感器测定压力,使测试压力条件分别为100 Pa、600 Pa和1200 Pa,然后利用火焰喷灯将玻璃管密封,将发菜保存于极端低气压保存管内,使其在长时间存放后仍保持所需气压及气体组成(图2)。

2.3 培养方法

为了考察发菜耐受极端温度和极端低气压程度,将发菜低气压处理器放在-20℃冰柜中,通过温度传感器全程监测温度,如图3所示,并设定不同处理时间(4天、7天、15天、30天和60天)。利用LED光源模拟类地行星表面光照,光谱波长范围为420 nm到680 nm,最大波长为560 nm,其光谱图见图4。光照阶段光强以地表光强40%(800 μmol photons/m2/s)为上限成正弦波变化,光暗比14 h∶10 h。

此外,为了考察不同低气压下-20℃到25℃交替循环对发菜存活的影响。以天为循环周期,将存有发菜的低压处理器放在-20℃黑暗处理10 h,再将发菜转移到25℃光照处理14 h,光照条件如图4装置所示,分别处理10天、20天和30天。通过温度传感器全程监测温度。

2.4 呼吸速率和光合放氧速率测定

称取处理后发菜和未处理发菜各0.01 g,用去离子水清洗发菜3~4次,放在液体BG11培养基,25℃、40 μmol photons/m2/s下培养24 h。待样品培养好后,将发菜剪成长度小于0.5 cm的片段,置于反应杯中。每个样品设置了3~6个重复,测定方法采用oxygenmeter model 782(Strathkelvin,Glasgow,UK)氧电极测定,测定条件为:25℃,样品3 mL,光强为950 μmol photons/m2/s,通过加入少量Na2SO3粉末标定零刻度,以空气饱和的蒸馏水标定氧电极的满刻度[8]。

2.5 脂肪酸含量测定

称取处理后发菜20 mg测定脂肪酸组成,其方法参考文献[9]。具体步骤:在10 mL圆底烧瓶加入20 mg样品和小转子,之后用100 μL注射器取50 μL浓度为2 mg/mL的C17 TAG溶液作为内标,之后加入5 mL 2%的硫酸-甲醇溶液后,70℃600 rpm油浴反应1 h,冷凝回流。反应结束后,冷却20 min至室温后,加入0.75 mL的去离子水和2 mL的正己烷,磁力搅拌器搅拌1 min,之后转移到15 mL离心管中,2000 rpm离心2 min,取上层相1 mL加入到气相色谱样品瓶中进行分析。气相色谱(GC)检测条件:色谱柱为DB-23色谱柱(30 m length×0.32 mm,I.D∗0.25 μm film),FID检测器温度270℃,进样口温度270℃,升温程序为起始温度130℃,之后10℃/min升到170℃,最后2.5℃/min升到200℃,进样量1 μL。每个样品做了2个重复。

2.6 脯氨酸含量测定

将处理后发菜样品研磨成粉末,由北京质谱医学研究有限公司采用HPLC-MS/MS进行LC液相(戴安公司Ultimate3000)、MS质谱(美国AB公司API 3200 Q TRAP)测定。每个样品测定了1次。

2.7 统计学分析

通过STATISTICA®7.0(StatSoft Inc.,Tulsa,OK,USA)软件,采用方差分析(ANOVA)和多重比较Tukey’s(HSD)分析实验数据。

3 结果和讨论

3.1 极端温度和极端低气压下发菜的呼吸和光合速率变化

表1显示的是不同气压下分别处理4天、7天、15天、30天和60天的发菜的呼吸和光合作用速率。结果显示:在-20℃,气体组成为95%体积的CO2和5%体积的N2、气压为100 Pa、600 Pa和1200 Pa(分别相当于大气压的0.1%,0.6%和1.2%),无论是处理4天、7天、15天、30天甚至是60天,发菜的呼吸和光合作用恢复与未处理发菜样品之间没有显著性差异,它们的光合速率平均在400 μmol O2/h/g(DW),呼吸速率大约在100 μmol O2/h/g(DW)。这说明发菜能够耐受低气压和极端温度,这种特性不会随着时间的延长而发生改变,也表明发菜能够长期耐受极端温度和极端低气压。然而,对于发菜是如何抵御这种环境条件的机制有待于后续进一步研究。

3.2 低温-高温反复交替下发菜的呼吸和光合速率变化

表2是不同极端低气压下,-20℃到25℃交替处理10天、20天和30天的发菜的光合及呼吸速率。从表中可以看出,不论-20℃到25℃交替处理时间是10天、20天还是30天,经过处理的发菜的光合放氧和呼吸速率样品与正常相比没有差异,仍然保持在大约光合放氧为400 μmol O2/h/g(DW)和呼吸作用速率为100 μmol O2/h/g(DW)。这说明发菜在100 Pa、600 Pa和1 200 Pa条件下,-20℃到25℃处理不同时间对发菜的光合部件没有造成伤害,或者是发菜启动了相应的防护机制以抵御这种环境条件所造成的伤害,从而保护发菜的光合部件,导致发菜的光合活性没有受到损伤。以上实验结果说明发菜能够在极端低气压下耐受低温-高温反复交替,这表明了发菜在低气压下的长期冷热频繁交替不会影响其生命活动。然而,对于发菜是如何抵御这种环境条件的机制有待于后续进一步研究。

表1 -20℃不同气压下处理不同时间发菜光合和呼吸速率Table 1 The respiration and photosynthetic oxygen release rate of N.flagelliforme treated with different gas pressures at-20℃for different timeμmol O2/h/g(DW)

表2 -20℃到25℃不同气压下交替处理发菜的呼吸和光合作用速率Table 2 The respiration and photosynthetic oxygen release rate of N.flagelliforme treated with different gas pressures in-20℃to 25℃alternation for different timeμmol O2/h/g(DW)

3.3 发菜脂肪酸组成和脯氨酸含量变化

生物膜是生物将自身与环境分开的第一道屏障,这也导致生物膜是环境胁迫过程中发生损害的主要位点。目前很多研究表明不饱和脂肪酸在生物应对各种环境胁迫起到了很重要的作用[10-13]。脯氨酸是分布最广泛的一种渗透物质,大量研究表明植物细胞内的脯氨酸增加有利于抵抗不良环境[14-16]。

为了揭示发菜能够长期耐受极端温度和极端低气压以及低温-高温反复交替的机理,我们通过气相色谱测定了处理样品的脂肪酸组成并委托北京质谱医学研究有限公司采用液质连用测定了脯氨酸含量变化。从表3数据显示,发菜在1200 Pa、600 Pa和100 Pa气压下,-20℃到25℃交替处理30天,其脂肪酸组成主要是C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2和C18:3,其中C16:1和C18:3所占脂肪酸比例最高,分别大约为26%和30%。C18:0分别为1.38%、1.44%和1.27%,C18:1n9分别为5.02%、3.77%和2.28%,相比正常样品的C18:0为0.92%有显著性上升,这可能会增强膜的流动性。C18/C16脂肪酸比例在正常和1200 Pa、600 Pa和100 Pa气压下分别为1.16、1.21、0.89和1.15,可以看出在600 Pa低温高温交替下,C18/C16比例数值有所下降,但是没有构成显著性差异。以上结果显示发菜在1200 Pa、600 Pa和100 Pa气压下,-20℃到25℃交替处理30天,发菜脂肪酸组成发生了变化,C18:0有显著性上升,这些可能与发菜耐受低温高温交替有关。此外不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例与正常相比没有显著性差异,说明发菜不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例在低气压下低温高温交替很稳定,这对于维持发菜正常活性起到一定的保障作用。

此外,如表4所示,不同气压下处理60天发菜脂肪酸变化情况和不同气压下低温高温交替规律很相似,C18:1n9比对照上升,总的不饱和脂肪酸所占比例与正常没有显著差异,而C18:C16在600 Pa处理后数值有所下降,但是相比正常没有显著性变化。然而有研究指出发菜随着培养温度从30℃降到15℃,C18:C16是下降的趋势[17]。这说明发菜在响应低压胁迫与温度胁迫的脂肪酸反应策略不一样。

从表5中可以看到,在1200 Pa、600 Pa和100 Pa气压下,-20℃到25℃交替处理30天发菜的脯氨酸含量分别为51.04 μg/g(DW)、28.53 μg/g(DW)和47.29 μg/g(DW),而正常发菜的脯氨酸含量为28.32 μg/g(DW)。因此,1200 Pa和100 Pa气压下,-20℃到25℃交替处理30天,发菜的脯氨酸含量分别相比正常样品增加了80%和67%。大量研究表明植物细胞内的脯氨酸增加有利于抵抗不良环境。脯氨酸亲水性强,既有亲水部分又有疏水部分,可以与蛋白质的疏水部分结合,不影响蛋白质内部的疏水部分,使蛋白质不致变性,对蛋白质起到一定的保护作用。此外,脯氨酸可以与细胞内的一些化合物形成聚合物,类似亲水胶体,有一定的保护作用,可防止细胞脱水[14]。因此,发菜可能通过调节胞内游离的脯氨酸含量抵抗极端低气压所造成的伤害。另外,在-20℃、1200 Pa气压下处理60天,发菜脯氨酸37.38 μg/g(DW),比未处理样品上升了约32%,而600 Pa和100 Pa气压下,发菜脯氨酸含量没有显著性差异,这可能是因为这种处理对发菜没有造成伤害,所以脯氨酸含量没有增加。

表3 -20℃到25℃不同气压下交替处理30天发菜的脂肪酸组成Table 3 Changes of fatty acid composition(%)in N.flagelliforme treated with different gas pressure in-20℃to 25℃alternation for 30 days

表5 -20℃不同气压下处理60天发菜和-20℃到25℃不同气压下交替处理30天的脯氨酸变化Table 5 The proline change of N.flagelliforme treated with different gas pressures in-20℃to 25℃alternation for 30 days and at-20℃for 60 days respectivelyμg/g(DW)

4 结论

1)当发菜在-20℃、气体组成为95%CO2、5%N2、气压分别为100 Pa、600 Pa和1200 Pa长期处理达60天,发菜的光合速率与正常相比没有差异,平均在400 μmol O2/h/g(DW),呼吸速率大约在100 μmol O2/h/g(DW),说明发菜能够长期耐受低温和极端低气压;

2)当发菜在气体组成为95%CO2、5%N2,气压分别为100 Pa、600 Pa和1200 Pa,在-20℃到25℃交替处理30天,发菜的光合及呼吸速率与正常相比没有差异,大约光合放氧为400 μmol O2/h/g(DW),呼吸作用速率为100 μmol O2/h/g(DW),说明发菜能够在极端低气压下耐受低温-高温反复交替;

3)发菜能够抵御极端低气压和低温高温反复交替的原因可能包含调节胞内脂肪酸组成以及游离脯氨酸含量。

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Effects of Low-high Temperature Alternations on Photosynthetic Physiology of Nostoc flagelliforme after Extreme Low Gas Pressure Exposure

LIU Yinghui,CHU Yadong,LU Hongbin,CAO Xupeng,XUE Song∗
(Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China)

In order to examine whether Nostoc flagelliforme can survive on terrestrial planets or not,an experimental apparatus providing extremely low air pressure for simulating terrestrial planet environment was constructed,and theeffects of low-high temperature alternation on the photosynthetic physiology of Nostoc flagelliforme under extremely low air pressures were investigated.It was found thatunder a gas atmosphereof CO2/N2(95/5,v/v),the respiration and photosynthetic oxygen release rate of N.flagelliforme were not affected when it was treated with various extremely low gas pressures(100 Pa,600 Pa,1200 Pa)for 4 days,7 days,15 days,30 days and 60 days at-20℃,

respectively.In addition,when N.flagelliforme was subjected to-20℃to-25℃alternation under different low gas pressuresfor 10 days,20 days and 30 days,the respiration and photosynthetic oxygen release rates showed also no difference as compared with the control.These results indicated that N.flagelliforme might survive under an extremely low gas pressure with low-high temperature alternations.Furthermore,the free proline contents increased and fatty acid composition changed when N.flagelliforme was treated with the extremely low gas pressure and low-high temperature alternations,which could be the material foundations for the tolerance capability of N.flagelliforme in response to these extreme environments.

Nostoc flagelliforme;low air pressure;photosynthesis;respiration;proline

Q935

A

1674-5825(2017)06-0829-06

2017-04-24;

2017-09-19

刘颖慧,女,博士,副研究员,研究方向为蓝藻光合和胁迫生理。Email:lyh8423@163.com

∗通讯作者:薛松,女,博士,研究员,研究方向为微藻生物能源。Email:xuesong@dicp.ac.cn

(责任编辑:庞迎春)

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