狭叶红景天种子萌发和愈伤组织诱导最佳培养条件筛选

2017-12-04成都大学四川抗菌素工业研究所四川成都6005成都大学药学与生物工程学院四川成都6006

种子 2017年7期

，，，，， (.成都大学四川抗菌素工业研究所，四川成都 6005；.成都大学药学与生物工程学院，四川成都 6006)

刘洪明1，王跃华2，陈沙2，甘晓慧2，刘鑫2，彭梅2
(1.成都大学四川抗菌素工业研究所，四川成都 610052；2.成都大学药学与生物工程学院，四川成都 610106)

[目的]以狭叶红景天种子为实验材料，探索其种子萌发和愈伤组织诱导的最佳培养条件。[方法]通过对狭叶红景天种子不同浸泡时间和消毒时间的筛选，获得种子萌发最佳培养条件；并进一步选取狭叶红景天的无菌苗的幼叶为外植体，采用不同植物激素的配比进行愈伤组织诱导培养，最终筛选出狭叶红景天愈伤组织诱导培养的最佳条件。[结果]狭叶红景天种子萌发的最佳培养方式为将未经浸泡的种子，先采用酒精消毒20 s后再经升汞消毒20 min，其种子的染菌率为0%，萌发率为(61.8±0.21)%；狭叶红景天幼叶诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 3 mg/L+KT 0.1 mg/L，在培养30 d后愈伤组织诱导率可达98%以上。

狭叶红景天；种子；无菌苗；愈伤组织

狭叶红景天(Rhodiolakirilowii(Regel) Maxim)又名狮子七、狮子草、九头狮子七、涩疙瘩，为景天科红景天属多年生草本植物，生于海拔2 000～5 600 m的山地多石草地或石坡上，主产于我国西藏、云南、四川、新疆、青海、甘肃、陕西、山西、河北等省，缅甸也有分布[1]，是珍稀药用植物之一。狭叶红景天根茎可药用，具有活血调经，清肺养胃，止血止痢等功效[2]。最近研究表明，狭叶红景天还具有预防高原反应、活血化瘀、提高耐缺氧能力、辐射保护等作用[3-6]，此外，狭叶红景天提取物还可以预防和延缓衰老、抗菌和增强免疫力的功效[7-9]。

近年来，由于狭叶红景天功效突出、工业化程度高，经济效益和社会效益十分显著，国内外竞相开发利用；加之其生长条件恶劣、自然繁育难，自然条件下萌发率仅为11.3%[10]，自然繁殖率极低，而连年的无序开发，导致有限的资源逐年减少,甚至濒危，这些都极大的制约了其产业的可持续化开发利用。为解决这一难题,本研究采用生物工程技术，以狭叶红景天种子为对象进行了无菌苗培养和愈伤组织诱导研究。

1 材料和方法

1.1 材料

狭叶红景天种子采自四川省阿坝州红原县，经鉴定为景天科(Crassulaceae)红景天属(RhodiolaL.)植物狭叶红景天(Rhodiolakirilowii(Regel) Maxim)的种子。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒方法

将种子从果实中取出后，筛选粒大饱满的种子，用无菌水于5 ℃冰箱中浸泡8 h。在超净工作台上，先用70%酒精消毒20 s后，再用升汞分别处理A1(0 min)、A2(10 min)、A3(20 min)，最后用无菌水冲洗干净后，接入MS的基本培养基中进行种子萌发培养，本实验重复3次。

1.2.2 种子浸泡方法

将筛选好的种子分装于5 mL的灭菌离心管中，用无菌注射器注入约3 mL无菌水，放于5 ℃冰箱中进行浸泡，浸泡过程中每隔1 h摇动1次，浸泡时间分别为B1(0 h)、B2(8 h)、B3(12 h)，每4 h更换1次无菌水。浸泡结束后，按照1.2.1中消毒方式升汞消毒20 min，处理完毕后接种于MS基本培养基中,上述实验重复3次。

1.2.3 愈伤组织诱导

待上述种子萌发、生长后，在超净工作台上取出无菌苗，切取幼叶接入由不同激素配比设计的L16(44)正交实验中进行愈伤组织诱导培养，并进一步研究由6-BA、2,4-D和KT 3种激素不同组合对其愈伤组织诱导的影响(见表1)。

1.2.4 培养基和培养条件

种子萌发和愈伤组织诱导所用的MS基本培养基中蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH调至5.8；培养条件为温度20 ℃、光照24 h和光照强度2 000 lx。

表1 因素水平

水平 A 6⁃BA(mg/L) B 2，4⁃D(mg/L) C KT(mg/L)100020．310．130．520．240．730．3

1.2.5 数据处理

本试验数据处理由Excel 2007和正交设计助手ⅡV 3.1完成。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对种子萌发的影响

利用升汞消毒是植物组织培养过程中的常见方法，本实验设计3种不同消毒时间和空白对照对狭叶红景天种子升汞消毒实际进行考察，将消毒后种子接种于MS基本培养基中，培养12 d统计结果见表2。

表2 不同消毒时间对狭叶红景天种子萌发的影响

实验编号消毒时间(min)萌发率(%)(X±S，n=3)染菌率(%)(X±S，n=3)幼苗生长状况X103．5±2．68100很快染菌，仅有极少数能长出子叶。X21067．3±1．3213±3．61种子萌发快，幼苗胚轴为浅绿色，根尖有红色物质，生长良好。X32061．8±0．210种子萌发较快，幼苗胚轴为浅绿色，根尖有红色物质，生长良好。X43039．9±0．140种子萌发时间长，幼苗胚轴为绿白色，仅少数为浅绿色，生长不良。

注：12 d后统计结果。表3同。

从表2可看出，升汞消毒时间对狭叶红景天种子在无菌条件下的萌发率、染菌率和萌发时间都有明显的影响，与杨云贵[11]等报道升汞消毒对高羊茅种子萌发率影响不大的结论不一致，分析原因可能是不同种子对升汞的抗性存在差异。实验结果显示，不使用升汞消毒时，种子染菌情况严重，仅有极少数种子在染菌前萌发，染菌后死亡。这主要由于狭叶红景天种子体积小，染菌严重影响了种子萌发，出现染菌后，种子很快就死亡。随着升汞消毒时间的增加，染菌率降低，种子萌发率也逐步降低。当消毒10 min时，种子最高萌发率(67.3±1.32)%，但有(13±3.61)%存在染菌情况。消毒时间增加到20 min时，种子萌发率较高，为(61.8±0.21)%，且种子不存在染菌情况。消毒时间继续增加到30 min，种子虽然未染菌，但萌发率仅为(39.9±0.14)%，说明消毒30 min对狭叶红景天种子的种胚造成了严重伤害，最终大大地降低了萌发率。综上，选择消毒20 min的A3处理作为最佳升汞消毒时间。

2.2 不同浸泡时间对种子萌发的影响

浸种可使种子提前吸收发芽所需要的水分，有利于种子快速萌发和打破休眠[12]，通常种子无菌萌发是采用先消毒后浸泡的方式，但此方法在种子浸泡过程中易染菌，且密闭浸泡又不能保证种子呼吸作用的需氧量。故本实验选择现将种子浸泡后再进行消毒的方式，筛选狭叶红景天种子无菌萌发前的浸泡时间，可降低缺氧对种子造成的危害。处理后种子接于MS基本培养基中，12 d后统计结果见表3。

表3 不同浸泡时间对狭叶红景天种子萌发的影响

实验编号消毒时间(min)萌发率(%)(X±S，n=3)Y1078．84±2．59Y2867．33±4．73Y31235．18±6．29

从表3可看出，狭叶红景天种子随浸泡时间增加，萌发率逐步降低。种子不经过浸泡萌发率最高，为(78.84±2.59)%；其次为浸泡8 h，萌发率为(67.33±4.73)%；浸泡12 h萌发率最低，仅为(35.18±6.29)%。这一结果与普通种子萌发实验结论不同，笔者认为原因可能有2点： 1)实验所用狭叶红景天种子未经过严格干燥处理，种子本身含水量较高，不需要吸收更多水分； 2)种子经过较长时间的浸泡后，种子内部会出现严重的缺氧，也会影响其种子的萌发。

2.3 愈伤组织诱导结果

愈伤组织诱导是植物生物技术育苗的重要步骤，本实验选用了细胞分裂素6-BA和2种细胞生长素KT、2,4-D相互配比进行正交实验，优选最佳激素配比，提高愈伤组织诱导率，外植体培养30 d后统计结果，见表4、表5。

实验设计了16种愈伤组织诱导培养基，通过对整个诱导过程中愈伤组织诱导和生长情况观察，接种后第6天，便有部分外植体叶柄基部开始愈伤化；第14天可观察到长出的愈伤组织；第25天愈伤组织的诱导率较之前2 d已无变化。，实验中可观察到6种形态各异的愈伤组织。从愈伤组织致密程度和增殖情况来看，有3种最为典型，以2号(A1B2C2)绿色的颗粒状愈伤组织最为致密，但增殖速度较慢见图1 A；最为疏松的是5号(A2B1C2)，产生的黄绿色愈伤组织，增殖速度最慢(见图1 B)；12号(A3B4C2)所形成的白绿色愈伤组织紧密程度处于二者之间，增殖速度最快(见图1 C)。

图1 愈伤组织形态图

表4 愈伤组织诱导直观分析表

实验编号因素ABC误差愈伤组织诱导率(%)(X±S，n=3)1111102122275．71±0．073133378．68±1．154144481．12±2．615212465．65±2．596221368．58±1．097234278．23±4．548243188．51±0．979313259．23±1．7110324188．90±2．8411331493．45±3．9612342398．34±1．4913414329．60±2．5514423439．04±1．2415432176．93±3．5716441282．02±0．62k10．5890．3860．6100．636k20．7520．6810．7920．738k30．8500．8180．6650．688k40．5700．8750．6950．699R0．2800．4890．1820．102

注：表中愈伤组织诱导率为接种后30 d统计结果。

对愈伤组织诱导率进行极差和方差分析，结果(表4、表5)发现，2,4-D对狭叶红景天愈伤组织的诱导有很大的影响，效果达显著水平，未达极显著水平；6-BA的影响同样为显著水平，但不如2,4-D高；KT对愈伤组织诱导的影响不显著。各因素对愈伤组织诱导率的影响作用依次为2,4-D浓度>6-BA浓度>KT浓度，本实验得出最优激素配比为A3B4C2，即MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 3 mg/L+KT 0.1 mg/L。正好为实验设计的12号配方，实验结果也表明，其愈伤组织诱导率和愈伤组织生长情况均为最优。

表5 愈伤组织诱导方差分析

因素偏差平方和自由度F比F0．05F0．01显著性A0．216310．2869．2829．5∗B0．572327．2389．2829．5∗C0．06933．2869．2829．5误差0．023

3 讨论

众所周知，外植体越幼嫩，诱导愈伤组织活性越强。为保证外植体的幼嫩，同时避免消毒剂对幼嫩外植体的损害，将种子消毒后，在无菌培养基上萌发，利用长出的无菌苗为外植体进行愈伤组织诱导研究。对种子前处理方式和愈伤组织诱导激素配比进行了探究试验。

据报道，在常用的几种消毒剂(次氯酸钙、次氯酸钠、过氧化氢、溴水、硝酸银、升汞、抗生素)中，升汞的消毒效果最好[13]，而酒精可溶解种子表面的疏水性物质，增强升汞消毒作用，故本实验选择酒精和升汞作为消毒剂进行种子的消毒研究。当然，本实验对消毒剂的选择还不够全面，狭叶红景天种子消毒方式还有待进一步系统研究。

对于同一种植物，外植体脱分化形成愈伤组织不仅同外源激素有关，也同外植体本身的内源性激素有关。采用外植体的部位不同，诱导愈伤组织的激素种类和水平也不相同，李建民等[14]采用狭叶红景天顶芽进行愈伤组织诱导，培养基配方为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+LH 300；李伟等[15]采用叶和茎为外植体，培养基配方为MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.3 mg/L，均取得了良好成效。本实验采用了2,4-D、KT、6-BA 3种植物激素，对狭叶红景天无菌苗的叶进行了愈伤组织的诱导，得出2,4-D对愈伤组织诱导率影响最为显著，筛选出了最佳培养基配方。但对外植体种类筛选、多种激素考察、培养基配方筛选等，还应作进一步系统研究。

另外，实验还对整个愈伤组织诱导过程进行了细致的观察，发现不同初代愈伤组织的生长规律及其存在的多态性问题，主要表现在外部形态的不同和增殖能力的明显差异。关于该问题，沙红等[16]在对大花红景天的研究中亦有提及。究其原因，笔者认为可进一步对不同形态的愈伤组织进行解剖学观察，观察不同生长期愈伤组织内分布的分生细胞分化情况，探究其细胞水平上的分化过程。具体研究方法，还需进一步深入研究讨论。

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Screening of the Best Callus Induction Culture Conditions and Seed Germination forRhodiolaKirilowii

LIUHongming1,WANGYuehua2,CHENSha2,GANXiaohui2,LIUXin2,PENGMei2

2017-02-28

四川省科技支撑计划项目(2015 SZ 0034)。

刘洪明(1993—)，男，四川眉山人；在读硕士研究生；研究方向：生药学；E-mail:617211684@qq.com。