LncRNAs在糖尿病神经血管病变中的研究进展

许玉荣, 李桂林

(南昌大学医学院生理学教研室，江西 南昌 330006)

糖尿病是个全球性的问题，近年，多数国家糖尿病患者的人数呈不断增加的趋势，在糖尿病患者中，目前仍有约1.87亿人没有被诊断出来。糖尿病是一种因胰岛β细胞功能障碍或胰岛素分泌减少而导致糖稳态失衡的复杂代谢性疾病。对于糖尿病发病的分子机制，大多数研究都集中在胰岛细胞类型的转录组水平[1]，而对于长非编码核糖核酸(long noncoding RNAs，lncRNAs)在糖尿病发病中的作用研究较少。

人类基因组蛋白编码基因约有2万个，而这仅占全基因组的1.5%[2]。因此，有98%以上的人类基因不编码蛋白质。这些不编码蛋白质的转录本根据其长度可分为小非编码RNA和长非编码RNA。长非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸的重要的异构非编码RNA[3]。近年研究结果显示，lncRNAs在表观遗传学水平、转录及转录后水平参与基因表达的调节，在生物学过程中发挥关键作用。LncRNAs具有多种功能，如RNA加工、结构支架、调控细胞凋亡和侵袭、诱导重新编程多功能干细胞、染色质修饰等[4]。目前，研究发现，多种lncRNAs参与了糖尿病并发症过程，如糖尿病神经病变、糖尿病肾脏病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病心血管病变等，但目前对于lncRNAs的作用机制方面却仍知之甚少。随着研究人员对lncRNAs在哺乳动物进化及人类疾病发生发展中作用的日益关注，lncRNAs参与各种疾病调控的机制已成为当前生命科学研究的新热点。近年来，随着大量lncRNAs的发现以及对其功能研究的深入，lncRNAs在多种常见病和多发病中的作用机制的研究也越来越多，本文将对lncRNAs在糖尿病神经病变和心血管病变中的作用进行综述。

1 LncRNAs

1.1LncRNAs功能LncRNAs参与多种重要的生物功能调控过程。几乎能影响基因生命周期中遗传输出的每一个阶段，从表观遗传调控到染色质重塑，再到转录和转录后控制，以及蛋白质代谢的调控过程。

1.1.1表观遗传调控 LncRNAs的一个标志功能是它们介导的表观遗传调节能力。LncRNAs不但可以通过调节组蛋白和DNA的化学修饰，行使基因表达调控的功能，而且可以通过类似的机制调控表观遗传通路本身的基因。LncRNAs能够实现基因调节的DNA结合蛋白和DNA序列紧密连接，从而对不同的顺式或反式基因位点进行的表观遗传学修饰提供一个理想的对接平台。许多lncRNAs识别蛋白质的方式是通过染色质修饰来实现的，表观遗传修饰抑制也改变了lncRNAs的表达模式，这表明它们的调控是由染色质状态和前馈来控制的[5]。

1.1.2转录及转录后调控 RNA代谢的每一步都会进行精确调整及复杂的调控。研究发现，lncRNAs参与RNA稳定性的控制，包括mRNAs前体加工和mRNA降解。LncRNAs转录调控显然是非常复杂的，许多有注解的转录子可能是从蛋白质编码基因的初始转录物转录后加工得到的[6]。调控RNA的不同作用远远超出表观基因组，他们以各种方式调节转录。非编码RNA可以通过碱基配对的方式与DNA或RNA靶点结合，以掩盖剪接位点、miRNA结合位点及启动子，从而改变基因表达或蛋白质功能。此外，lncRNAs还可以作为转录辅激活而起作用。而且蛋白质定位及定位功能，也可由lncRNAs调控。核糖核酸具有独特的生化特性，识别并结合大多数生物分子，故与蛋白质的亲和力更甚，因此，lncRNAs可特异性结合蛋白。研究表明lncRNAs是通过直接结合和修饰蛋白活性来实现组织稳态的控制。LncRNAs介导调控的蛋白质活性还可以通过与转录因子的结合来实现[6]。

Tab 1 LncRNAs implicated in diabetes

1.2LncRNAs对基因表达影响的研究方法研究lncRNAs在基因表达中的作用和确定lncRNAs是顺式还是反式调节，通常需要通过功能缺失或功能获得实验来分析[7]。功能缺失大多采用RNA干扰技术，通过如短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)敲低lncRNAs的表达后，经高通量测序或基因芯片来确定它们在转录中的作用。以RNA功能缺失后受影响的相关基因为基础，来推断lncRNAs的功能。当然RNA干扰技术的干扰效率问题也随即出现，因为shRNA的干扰机制主要在细胞质内，而很多lncRNAs位于细胞核内。但这种担心随着越来越多的lncRNAs被成功敲低而解除。大多数敲低了的lncRNAs在细胞培养中都表现出明显的表型。除shRNA外，还有一种定点法使用锌指核酸酶将RNA去稳定化元件整合到lncRNAs终止元件功能序列中，如聚腺苷酸信号、腺嘌呤-尿嘧啶富集元件等，使下游序列稳定性破坏，从而产生比RNA干扰更特异更有效的干扰效果[7]。

失调的lncRNAs可通过多种途径在疾病的发生和发展中发挥重要作用。接下来将介绍与糖尿病相关的一些长非编码RNA失调引起的糖尿病并发症。

2 LncRNAs与糖尿病之间的关系研究

糖尿病主要分为两类：1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)，是自身免疫性疾病，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，是表征为胰岛素抗性及胰岛β细胞功能受损的一种疾病。T2DM是我国最常见的糖尿病，95%以上的糖尿病患者属于T2DM。糖尿病引起的并发症主要是神经和血管病变。糖尿病神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一，病变可累及中枢神经及周围神经，后者尤为常见。其中远端感觉神经病变是最常见的病变，占所有糖尿病神经病变的50%以上。糖尿病的血管病变是常见的糖尿病并发症之一，这也是导致糖尿病病人死亡的主要原因之一。血管病变又分大血管病变和微血管病变。LncRNAs参与糖尿病的发病，见Tab 1。

2.1LncRNAs与糖尿病神经病变糖尿病性神经性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是常见的糖尿病神经病变。但DPN 发病机制尚不明确，其中，血糖升高、血脂异常是导致外周神经损伤的重要因素。其可通过氧化应激，激活多元醇通路、内质网应激、线粒体功能障碍等途径，引起外周神经的损伤。此外，神经滋养血管病变、神经营养因子、外周神经的解剖学特点等因素也参与了DPN发病机制。近期有研究表明，lncRNAs的表达异常也与DPN的发病机制有明显的关联[15]。

LncRNA uc.48+是一种在各个物种之间具有高度保守性的长非编码RNA。DNP病人血清中uc.48+的表达水平较正常人群提高了3倍。在DNP模型大鼠背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)中，uc.48+的表达较正常对照大鼠明显升高[16]。糖尿病模型组大鼠的机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)较正常大鼠明显降低。然而，糖尿病大鼠经uc.48+小干扰RNA处理后，其MWT和TWL均较糖尿病模型组大鼠明显升高。此外，uc.48+小干扰RNA可降低糖尿病大鼠背根神经节ERK1/2、MAPK磷酸化水平及P2X3受体表达。因此，DNP的发生可能与uc.48+的过表达存在联系，而uc.48+小干扰RNA可缓解DNP，其机制与P2X3受体和ERK1/2信号通路有关[16]。

另有研究表明，T2DM患者血清中lncRNA NONRATT021972浓度较健康受试者明显升高。而NONRATT021972 siRNA处理T2DM大鼠后，其痛行为明显减轻，表明NONRATT021972 siRNA可能减轻神经病理性疼痛。同时，NONRATT021972 siRNA可明显降低DNP大鼠DRG中 P2X3受体表达水平、抑制ERK1/2的磷酸化、降低血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。因此，NONRATT021972 siRNA可通过抑制P2X3受体的表达上调、减少TNF-α的释放，缓解由糖尿病引起的痛觉过敏[17]。故DNP的发生可能与lncRNA NONRATT021972的表达增加存在一定联系，而NONRATT021972 siRNA则可缓解DNP，且其机制与P2X3受体和ERK1/2信号通路有关。故不同种类lncRNAs可能参与到同一疾病的调控过程中。

高糖和高游离脂肪酸是造成糖尿病神经系统损伤的主要原因。高糖高脂联合处理PC12细胞，导致IL-6和TNF-α水平明显升高，同时NONRATT021972的表达也明显增加。对高糖高脂联合处理PC12细胞诱导的NONRATT021972高表达进行小干扰RNA处理后，可抑制细胞中IL-6和TNF-α水平的升高。P2X7受体因在神经系统炎症相关性疾病的病理生理中产生作用而备受关注，研究表明，发生神经系统炎症相关性疾病时，P2X7受体表达上调，并可影响炎性介质的表达和释放，参与神经系统炎性反应，诱导神经细胞功能损伤，是神经系统炎症相关性疾病治疗的新靶点。高糖高脂状态下，PC12细胞中P2X7mRNA和蛋白表达明显升高，而进行NONRATT021972 siRNA处理后，P2X7mRNA和蛋白明显下降。因此，抑制NONRATT021972可以作为糖尿病性神经炎症并发症的新治疗策略[18]。因此，同一种lncRNA也可能通过不同途径参与到不同疾病的调控过程中。

糖尿病认知功能障碍是糖尿病中枢神经系统损伤造成的。有研究表明，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可加重糖尿病小鼠的认知障碍，包括焦虑样行为加剧、空间学习和记忆能力减退，尤其是空间逆转记忆能力的减退。3-MA减弱糖尿病小鼠的长时程增强和增益效应，表明3-MA可加重糖尿病小鼠突触可塑性的损伤。3-MA也可导致糖尿病小鼠海马神经元凋亡。然而，3-MA可使糖尿病时上调的lncRNA浆细胞瘤变异易位1基因(plasmacytoma variant translocation 1 gene，PVT1)的表达明显下降，推测PVT1参与了自噬。PVT1可以改善糖尿病小鼠海马神经元的突触可塑性损伤及细胞凋亡，进而改善糖尿病认知功能障碍[13]。

2.2LncRNAs与糖尿病血管病变大血管和微血管病变是糖尿病并发症的主要特点。在糖尿病血管病变中，血管内皮在其病理变化中起着一个关键性的作用。血管内皮不再看成仅仅是一层分隔血管内外的屏障，而是一个同时起着调节血管功能的具有分泌能力的重要器官。糖尿病时，内皮细胞受损伤并释放过多的细胞因子，从而引起炎症。因此，了解引起内皮炎症的分子机制，将有助于防止糖尿病患者血管内皮细胞损而最终导致的器官损伤。主要的血管系统疾病有糖尿病血管病变、动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等。LncRNAs 通过染色质重塑，转录、加工和转录后修饰等调节基因表达，进而参与到血管损伤、重塑和老化的调控过程中[19]。

肺腺癌转移相关转录物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一个6.5 kb核内长非编码RNA，在高血糖作用下诱导内皮细胞损伤[3]。MALAT1通过诱导蛋白如Bax、Bcl-2和p53，抑制肿瘤细胞死亡。而这些分子参与细胞周期的进展及血管生成与再生[20]。MALAT1在高糖处理12～72 h之内的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)表达即明显升高，同时白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和TNF-α也明显增多，机制研究表明，MALAT1对IL-6和TNF-α的调控是通过血清淀粉样蛋白A3(serum amyloid A3，SAA3)抗原完成的[21]。因此，MALAT1参与糖尿病血管内皮细胞的早期炎症反应。

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者中最常见的微血管并发症之一。视力减退、视网膜炎、视网膜新生血管的形成等与之相关。MALAT1参与DR的发病机制，在糖尿病患者的房水及纤维血管膜、糖尿病大鼠或小鼠的视网膜、高糖处理的视网膜内皮细胞系RF/6A中，MALAT1的表达水平均明显上调[22]。MALAT1敲低可改善糖尿病大鼠视网膜功能，减少视网膜细胞的凋亡，减少视网膜血管损伤，同时可明显减轻糖尿病引起的视网膜血管渗漏和视网膜炎症。MALAT1敲低可降低视网膜内皮细胞活力、减少细胞迁移和血管形成、防止内皮细胞的过度增殖。其机制与MALAT1敲低可以明显改变p38 MAPKs的磷酸化水平，而不是ERK1/2或JNK1/2磷酸化的水平有关[21]。

糖尿病使心肌梗死或局部缺血，加剧了心脏损伤。而缺血性事件导致糖尿病心脏并发症，在没有明显的心肌缺血和高血压症状下，增加了心脏衰竭的风险[23]。糖尿病性心肌病 (diabetic cardiomyopathy，DCM)是一个重要的糖尿病心血管并发症，表现为心功能不全发生独立的冠状动脉病和高血压，继续发展下去会带来心脏衰竭的重大危险及增加死亡率。DCM的特征在于各种形态变化，包括肌细胞肥大、肌原纤维枯竭、间质纤维化和心肌内微血管变化，显著特点是左心室功能的逐步减少[24]。DCM大鼠模型lncRNAs基因芯片检测发现，MALAT1明显上调。DCM模型大鼠MALAT1 shRNA 12周后，心肌细胞凋亡明显减少，左室收缩和舒张功能明显改善[4]。此外，在糖尿病引起的心脏收缩功能障碍的研究中发现，糖尿病心肌中MALAT1表达明显上调，TNF-α、IL-1β、IL-6水平也明显增加，MALAT1敲低可以明显减少炎性细胞因子的浓度，表明MALAT1参与了DCM的炎症过程[25]。

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)通常会引起慢性肾衰竭和终末期肾病。DN的主要特征是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肾小球中的过度积累。环境和遗传因素在DN发生发展中起主要作用。最近研究表明，表观遗传因素lncRNAs也与DN发病机制相关[25]。PVT1在多种肾细胞中均有表达，可能与1型或2型糖尿病终末期肾病进展有关。用葡萄糖处理的人肾小球系膜细胞PVT1表达明显上调，同时主要ECM蛋白——纤连蛋白1和IV型胶原蛋白α1及两种ECM蛋白的关键调节因子——转化生长因子β1和纤溶酶原激活物抑制剂1水平也明显上调。PVT1敲低可明显减少主要ECM蛋白和ECM蛋白的关键调节因子。因此，PVT1可能通过涉及ECM积聚机制来介导DN的发展进程[13]。心肌梗死相关转录本(myocardial infarction associated transcript, MIAT)参与糖尿病引起的肾小管损伤。在1型糖尿病大鼠肾小管中，MIAT表达水平降低，其表达水平与血清肌酐和尿素氮呈负相关。体外高糖诱导人肾小管上皮细胞株(HK-2)也观察到MIAT表达降低，细胞活力减弱。过表达MIAT可增加糖尿病和高糖条件下降低的核转录因子Nrf2的表达，并增加高糖条件下减弱的细胞活力。机制研究表明，MIAT可与核转录因子Nrf2结合，并负调控Nrf2的表达。MIAT通过稳定Nrf2的表达，调节近曲肾小管细胞活力[14]。

3 展望

目前人们对于lncRNAs认识仍然处于初步阶段，从最初的无意义片段到最近认识到lncRNAs具有多种生物学功能，几乎参与了生命进程的全过程。lncRNAs虽然不进行编码蛋白，但是却参与相关蛋白编码基因的调控。lncRNAs的失调将会引发多种与之相关的疾病。LncRNAs能够通过多种途径参与到糖尿病的发生、发展进程，并作用于各种糖尿病性疾病，可能是一种lncRNA参与多种糖尿病性疾病调控，也可能多种lncRNAs共同作用参与一种糖尿病性疾病的调控。目前，人们对lncRNAs在糖尿病神经血管病变中的作用仅限于功能或机制研究，但对于lncRNAs是否可以成为临床上糖尿病早期发现、病程进展和转归的诊断标志物，或开发改变lncRNAs表达(敲低或过表达)治疗糖尿病的药物仍无明显进展。

[1] Kameswaran V, Kaestner K H. The missing lnc(RNA) between the pancreatic beta-cell and diabetes[J].FrontGenet, 2014,5(5): 200.

[2] Tsai F J, Yang C F, Chen C C, et al. A genome-wide association study identifies susceptibility variants for type 2 diabetes in Han Chinese[J].PLoSGenet, 2010,6(2): e1000847.

[3] Wu Y, Huang C, Meng X, et al. Long noncoding RNA MALAT1: insights into its biogenesis and implications in human disease[J].CurrPharmDes, 2015,21(34): 5017-28.

[4] Zhang M, Gu H, Xu W, et al. Down-regulation of lncRNA MALAT1 reduces cardiomyocyte apoptosis and improves left ventricular function in diabetic rats[J].IntJCardiol, 2016,203: 214-6.

[5] Sun M, Kraus W L. From discovery to function: the expanding roles of long noncoding RNAs in physiology and disease[J].EndocrRev, 2015,36(1): 25-64.

[6] Kornfeld J W, Bruning J C. Regulation of metabolism by long, non-coding RNAs[J].FrontGenet, 2014,5: 57.

[7] Schonrock N, Harvey R P, Mattick J S. Long noncoding RNAs in cardiac development and pathophysiology[J].CircRes, 2012,111(10): 1349-62.

[8] Gao Y, Wu F, Zhou J, et al. The H19/let-7 double-negative feedback loop contributes to glucose metabolism in muscle cells[J].NucleicAcidsRes, 2014,42(22): 13799-811.

[9] Plagnol V, Howson J M, Smyth D J, et al. Genome-wide association analysis of autoantibody positivity in type 1 diabetes cases[J].PLoSGenet, 2011,7(8): e1002216.

[10] Salonen J T, Uimari P, Aalto J M, et al. Type 2 diabetes whole-genome association study in four populations: the DiaGen consortium[J].AmJHumGenet, 2007,81(2): 338-45.

[11] Zhu X, Wu Y B, Zhou J, et al. Upregulation of lncRNA MEG3 promotes hepatic insulin resistance via increasing FoxO1 expression[J].BiochemBiophysResCommun, 2016,469(2): 319-25.

[12] Carter G, Miladinovic B, Patel A A, et al. Circulating long noncoding RNA GAS5 levels are correlated to prevalence of type 2 diabetes mellitus[J].BBAClin, 2015,4:102-7.

[13] Li Z, Hao S, Yin H, et al. Autophagy ameliorates cognitive impairment through activation of PVT1 and apoptosis in diabetes mice[J].BehavBrainRes, 2016,305: 265-77.

[14] Zhou L, Xu D Y, Sha W G, et al. Long non-coding MIAT mediates high glucose-induced renal tubular epithelial injury[J].BiochemBiophysResCommun, 2015,468(4): 726-32.

[15] 杨秀颖, 张 莉, 陈 熙,等. 2型糖尿病周围神经病变机制研究进展[J]. 中国药理学通报, 2016,32(5): 598-602.

[15] Yang S Y, Zhang L, Chen X, et al. Advances in research on mechanism of peripheral neuropathy in type 2 diabetes mellitus[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(5): 598-602.

[16] Wang S, Xu H, Zou L, et al. LncRNA uc.48+ is involved in diabetic neuropathic pain mediated by the P2X receptor in the dorsal root ganglia[J].PurinergicSignal, 2016,12(1): 139-48.

[17] Peng H, Zou L, Xie J, et al. lncRNA NONRATT021972 siRNA decreases diabetic neuropathic pain mediated by the P2X receptor in dorsal root ganglia[J].MolNeurobiol, 2017,54(1): 511-23.

[18] Xu H, He L, Liu C, et al. LncRNA NONRATT021972 siRNA attenuates P2X7 receptor expression and inflammatory cytokine production induced by combined high glucose and free fatty acids in PC12 cells[J].PurinergicSignal, 2016,12(2): 259-68.

[19] 马 婧，凌 霜，党延启，等. 非编码RNA在血管损伤、重塑和老化中的作用[J]. 中国药理学通报, 2016,32(1): 14-8.

[19] Ma J, Ling S, Dang Y Q, et al. The role of non-coding RNA in vascular injury,remodeling,aging [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(1): 14-8.

[20] Tripathi V, Shen Z, Chakraborty A, et al. Long noncoding RNA MALAT1 controls cell cycle progression by regulating the expression of oncogenic transcription factor B-MYB[J].PLoSGenet, 2013,9(3): e1003368.

[21] Puthanveetil P, Chen S, Feng B, et al. Long non-coding RNA MALAT1 regulates hyperglycaemia induced inflammatory process in the endothelial cells[J].JCellMolMed, 2015,19(6): 1418-25.

[22] Yan B, Tao Z F, Li X M, et al. Aberrant expression of long noncoding RNAs in early diabetic retinopathy[J].InvestOphthalmolVisSci, 2014,55(2): 941-51.

[23] Bugger H, Abel E D. Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy[J].Diabetologia, 2014,57(4): 660-71.

[24] Zhang M, Gu H, Chen J, et al. Involvement of long noncoding RNA MALAT1 in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy[J].IntJCardiol, 2016,202: 753-5.

[25] Furtado M B, Costa M W, Pranoto E A, et al. Cardiogenic genes expressed in cardiac fibroblasts contribute to heart development and repair[J].CircRes, 2014,114(9): 1422-34.