4个马铃薯新品系的SSR分析

， ， 肖夏， ， ， (内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019)

4个马铃薯新品系的SSR分析

于卓，苏娜，于肖夏，马艳红，刘杰，张明飞
(内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019)

为明确H 027×陇薯6号和H-027×陇薯7号2个杂交组合杂种F1的4个优异新品系(A 2、A 10、B 1和B 12)在DNA水平上的遗传差异，利用SSR分子标记技术对4个新品系进行多态性分析。利用筛选出的10对SSR适宜引物，4个新品系及亲本共扩增出稳定而清晰的SSR条带142个，多态性位点百分率达81.69%；建立了能区分出4个优异新品系及其亲本的SSR指纹图；4个杂种新品系及其双亲的GD值变幅为0.229 8～0.650 8。 以GD值0.34为基准，7个马铃薯材料分为3类：第1类为新品系A 2、A 10和H-027，第2类为新品系B 1、B 12和陇薯7号，陇薯6号单独为1类。

马铃薯； 杂种F1； 优异新品系； SSR分析

马铃薯(SolanumtuberosumL.)为茄科茄属1年生草本植物，因其营养价值高且可作为粮、菜、饲及工业原料，在中国、俄罗斯、印度、乌克兰、美国等大面积种植，是仅次于小麦、水稻、玉米之后的世界第四大作物[1-4]。中国是世界马铃薯总产最多的国家。随着我国马铃薯主粮化战略的进一步实施，马铃薯在农业生产中的地位尤为重要，但是我国现有主要栽培品种遗传基础狭窄，尚不能满足生产发展的需要，亟待研发综合性状优良的马铃薯品种。为了选育出晚疫病抗性强、薯型好、芽眼浅、产量和商品薯率高、品质好、适宜在内蒙古中西部地区种植且能满足加工专用的马铃薯新品种，笔者基于亲本间遗传差异大、优缺点互补的组配原则，用淀粉含量较高、芽眼浅、薯型好的美国引进马铃薯品种H-027作母本，分别以抗晚疫病、黑痣病能力强的国产品种陇薯6号和陇薯7号作父本，通过人工授粉杂交和对杂种后代单株的精心选育，得到了H-027×陇薯6号和H-027×陇薯7号2个杂交组合的4个F1杂种优异新品系，即品系A 2、A 10、B 1和B 12。

表1 适宜SSR引物及其碱基序列

引物名称 正向引物 反向引物 S75’⁃GACTGGCTGACCCTGAACTC⁃3’5’⁃GACAAAATTACAGGAACTGCAAA⁃3’ S255’⁃GCGAATGACAGGACAAGAGG⁃3’5’⁃TGCCACTGCTACCATAACCA⁃3’ S1515’⁃GCTGCTAAACACTCAAGCAGAA⁃3’5’⁃CAACTACAAGATTCCATCCACAG⁃3’ S1535’⁃CCCTTACCCCTCTTCAATC⁃3’5’⁃TCTCTTCTCAGCTGCCGTCT⁃3’ S1705’⁃CGCAAATCTTCATCCGATTC⁃3’5’⁃TCCGGCGGATAATACTTGTT⁃3’ S1745’⁃TGAGGGTTTTCAGAAAGGGA⁃3’5’⁃CATCCTTGCAACAACCTCCT⁃3’ S1845’⁃TCATCACAACGTGACCCCA⁃3’5’⁃GGGCTTGAATGATGTGAAGCTC⁃3’ S1925’⁃ACTTCTGCATCTGGTGAAGC⁃3’5’⁃GGTCTGGATTCCCAGGTTG⁃3’ SSR595’⁃TTCGTTGAAGAAGATGATGGTC⁃3’5’⁃CAAAGAGGGCAAGCATCCAAGA⁃3’ STM30235’⁃AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA⁃3’5’⁃GTTCTGGCATTTCCATCTAGAGA⁃3’

SSR(Simple Sequence Repeat)分子标记具有重复性好、多态性丰富和共显性的优点，已广泛用于植物遗传图谱构建、基因定位、种质资源评价、分子标记辅助育种、品种真实性鉴定、遗传关系分析等方面[5-9]。如Fu等[10]采用SSR标记技术对169份国外马铃薯材料进行了遗传多样性分析；Liao等[11]用SSR标记分析了云南省85个马铃薯品种的遗传多样性；段艳凤等[12]用 SSR 分子标记技术构建了88个中国自主育成审定的马铃薯品种指纹图；刘文林等[13]用SSR分子标记对52份从俄罗斯引进的马铃薯品种进行群体结构性研究并构建其分子身份证；张自强等[14]利用SSR分子标记技术对36个马铃薯品种进行了遗传差异分析；但在马铃薯杂种后代的优良株系遗传差异分析中研究报道很少[15-16]。本试验拟用SSR分子标记技术对4个马铃薯新品系进行遗传差异分析，并建立其SSR指纹图，以期为下一步马铃薯优异新品种育成和登记利用提供依据。

1 材料与方法

材料为H-027×陇薯6号和H-027×陇薯7号2个杂交组合杂种F1的4个优异新品系A 2、A 10、B 1和B 12及其亲本，各材料由内蒙古农业大学马铃薯育种研究室提供。试验在呼和浩特市赛罕区东郊的内蒙古农业大学农学院农场进行。土壤为沙壤质土，肥力适中，pH值为7.8～8.2，具地下水灌溉条件。

1.2 研究方法

1.2.1 供试材料基因组DNA提取及检测

参照TianGen公司高效植物基因组DNA 提取试剂盒(DP 350)的说明方法，提取4个杂种新品系及其亲本材料苗期的基因组DNA。取2μL DNA溶液进行1.0%琼脂糖凝胶电泳纯度检测，稀释后于-20 ℃冷冻贮存。

1.2.2 SSR-PCR扩增反应

SSR-PCR反应体系的总体积为20μL，包含：模板DNA(50 ng/μL)1.0μL，10×PCR buffer(含Mg2+)2.0μL，dNTPs(0.225 mmol/L)1.4μL，上下游引物各(0.5μmol/L)0.7μL，TaqDNA聚合酶(5 U)0.09μL，ddH2O 14.11μL。PCR扩增反应体系所用的Buffer、Taq聚合酶、dNTPs等试剂均购自全式金生物工程有限公司。

SSR-PCR扩增程序：95 ℃模板预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR反应在Bio-Rad Mycycler Thermal Cycler上进行。待PCR扩增产物冷却至室温后，加6.0μL变性剂(10 mmol/L EDTA、98%甲酰胺、0.25%二甲苯氰FF、0.25%溴酚兰)，94 ℃变性5 min后立即取出放入-20 ℃冰箱中冷却3～5 min。

环流形势场上,16日白天近地面华东大部为高压后部控制,高压中心位于东部海上,浅层切变位于苏皖中部。随着切变线南压,夜里12时华东东部沿海转为东南偏东风,风速3～6 m/s(图2a)。合适的风向风速条件把海上暖湿水汽向内陆输送,在遇到冷下垫面后,给华东中部沿海大范围地区带来平流大雾天气(图2b)。

1.2.3 扩增产物电泳检测

配置6%变性聚丙稀酰胺凝胶、静置，在Bio-Rad PowerPac HV电泳仪70 W的恒定功率下，预电泳30 min，取5.5μL变性后的扩增反应产物上样，电泳约75 min。电泳结束后，胶板在固定液(蒸馏水1 800 mL、冰乙酸20 mL、酒精200 mL)中轻轻震荡固定18 min后，放入蒸馏水中漂洗3 min，在2.0%硝酸银(AgNO3)溶液中染色15 min后用蒸馏水速漂5 s，在显影液(蒸馏水2 000 mL、NaOH 60 g、甲醛10 mL)中显影至条带清晰后固定、漂洗，胶板晾干后扫描[17-18]。

1.2.4 SSR适宜引物筛选

本试验从NCBI网站公布的马铃薯200对SSR特异性引物中筛选出扩增条带清晰、稳定、且多态性位点多的适宜引物10对(表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成，用于各杂种F1优异新品系及其亲本的SSR分析。

注：1.♀H-027；2.♂陇薯6号；3.♂陇薯7号；4.新品系A 2；5.新品系A 10；6.新品系B 1；7.新品系B 12；A和B分别为引物S 170和S 174的SSR扩增结果。 图2 引物S 170和引物S 174对7个供试材料基因组DNA扩增的SSR指纹特征

1.2.5 SSR多态性位点统计及数据分析

对SSR等位基因扩增的多态性条带数目采用0/1赋值法进行统计，在相同位点上出现条带的记为“1”，无条带的记为“0”，按基因片段由大到小的顺序记录，生成“0”、“1”型二元数据矩阵，计算下列相关遗传参数[19]。

多态性条带百分率(Percentage of Polymorphic Bands，简称P)：P=扩增出的多态性条带数目/扩增出的条带总数×100%。

统计4个新品系及其亲本的遗传相似系数(GS)及遗传距离(GD)：GS=2Nij/(Ni+Nj)，公式中的Nij为材料i和材料j共有的片段位点数目，Ni+Nj为2个材料中出现的总片段位点数目，GD=1-GS[20]。

根据类平均聚类法(UPGMA)及软件DPS(Data Processing System)V 8.01进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 各材料基因组DNA质量的电泳检测

4个杂种新品系及其3个亲本材料基因组DNA电泳检测结果显示，电泳条带均匀、稳定、清晰，无拖尾和弥散现象(图1)。表明其DNA纯度很高，可满足SSR-PCR扩增分析对DNA质量的要求。

注：1.♀H-027；2.♂陇薯6号；3.♂陇薯7号；4.新品系A 2；5.新品系A 10；6.新品系B 1；7.新品系B 12；M.DL 2000。图1 7个供试材料的基因组DNA电泳检测结果

2.2 4个新品系及其亲本的SSR扩增

对4个马铃薯新品系及亲本进行PCR扩增，10对SSR引物共扩增出142个清晰稳定的SSR条带，其中多态性条带116个，平均每对引物扩增出14.2个，其多态性条带百分率占81.69%，表明各材料的多态性较丰富。10对适宜引物中引物S 174的多态性条带最多，引物S 25的最少，其多态性比率分别为100%和68.18%(表2)。

表2 杂种新品系及其亲本的SSR扩增结果

引物多态性条带扩增条带总数多态性比率(%)S7121392．31S25152268．18S151141973．68S153111478．57S170101190．91S1741313100．00S184111384．62S192121485．71SSR5971070．00STM3023111384．62合计(平均)11614281．69

另外，引物S 170和S 174扩增的SSR指纹图均能很好地将4个新品系和3个亲本材料区分开来(图2)，表明这2对引物可用于马铃薯新品系的鉴定。

2.3 4个新品系及其亲本的遗传相似性及聚类分析

马铃薯新品系及其亲本的遗传距离(GD值)变动在0.229 8～0.650 8之间，平均GD值为0.426 1。母本H-027与2个父本亲本之间的GD值分别为0.621 1和0.512 9，新品系B 1与父本陇薯6号的遗传距离最大，GD值为0.650 8，表明其亲缘关系较远，遗传差异大；新品系B 12与父本陇薯7号的遗传距离最小，GD值为0.229 8，表明其亲缘关系较近(表3)。

在遗传距离0.34处，7个马铃薯材料聚为3类，其中第1类为新品系A 2、新品系A 10和母本H-027，这2个新品系偏母本遗传；第2类为新品系B 1、B 12和父本陇薯7号，偏父本遗传；父本陇薯6号单独立为一类(图3)。

3 结 论

1) 试验筛选出SSR适宜引物10对， 7个马铃薯材料PCR扩增共得到稳定的SSR条带142个，其中多态性条带116个，多态性百分率为81.69%。

图3 7个供试马铃薯材料的SSR聚类结果

表3 供试材料的遗传距离矩阵

2) 用筛选出的2对SSR引物S 170和S 174，建立了4个马铃薯优异新品系及其亲本的DNA指纹图。

3) 4个新品系及其亲本的遗传距离(GD)变幅为0.229 8～0.650 8。以GD值0.34为基准，7个马铃薯材料分为3类：新品系A 2、A 10和母本H-027为一类，新品系B 1、B 12和父本陇薯7号为另一类，父本陇薯6号为单独的一类。

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SSR Analysis of Four New Strains of Potato

YUZhuo,SUNa,YUXiaoxia,MAYanhong,LIUJie，ZHANGMingfei
(Agronomy College,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010019,China)

In order to determine the genetic differences of new strains of potato in DNA level,SSR molecular marker technology was used for polymorphic analysis of four excellent new strains (A 2,A 10,B 1 and B 12) from the F1hybrids of two hybrid combinations H-027×Longshu No.6 and H-027×Longshu No.7.Using 10 SSR suitable primers to amplify genome DNA of four new srains and its’ parents,a total of 142 clear and stable SSR polymorphic bands were detected,and the polymorphic rate was 81.69%.A SSR fingerprint map was established,which could distinguish four excellent new strains and their parents.The genetic distance (GD) of test plants were from 0.229 8 to 0.650 8.This threshold 0.34 was adopted as GD value,seven tested plants were classified into three categories:the new strain A 2,A 10 and H-027 as a category;B 1,B 12 and Longshu No.7 as a category;and Longshu No.6 as separate category.

potato； hybrid F1； excellent new strains; SSR analysis

2016-12-09

内蒙古科技发展计划重点项目(2016 ZD)和内蒙古自然科学基金博士基金项目(2014 BS 0324)资助。

于 卓(1958—)，男，内蒙古托县人；博士，教授，博士生导师，主要从事马铃薯及饲用作物遗传育种；E-mail：yuzhuo58@sina.com。

于肖夏，内蒙古呼和浩特市人；博士，讲师，主要从事马铃薯及饲用作物遗传育种；E-mail：yuxiaoxia1985@sina.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.05.036

S 532

A

1001-4705(2017)05-0036-04