PMBE稳定牙本质基质及封闭牙本质小管的双重功效研究

唐成芳,曾 辉,张 莎,王丹杨,杨黎艳,谢 娜

(1西安医学院口腔医学系,西安 710021;2西安医学院药学院)

PMBE稳定牙本质基质及封闭牙本质小管的双重功效研究

唐成芳1,曾 辉1,张 莎1,王丹杨1,杨黎艳2,谢 娜1

(1西安医学院口腔医学系,西安 710021;2西安医学院药学院)

目的 观察马尾松树皮提取物(pinus massoniana bark extract,PMBE)稳定牙本质基质和封闭牙本质小管效果,为其防治牙本质过敏提供实验依据。 方法 制备牙本质块60个,随机分为6组(n=10):乙醇组,氟涂膜组,1%,2%,4%和8%PMBE组。酸蚀牙本质使牙本质小管开放,各组分别用无水乙醇,氟涂膜,1%,2%,4%和8%PMBE乙醇溶液涂刷牙本质表面。采用场发射扫描电镜观察牙本质表面及剖面的显微形貌,并测量牙本质小管口开放视野面积(ADTO)、牙本质小管口开放相对面积(PADTO)和小管封闭深度(SD)。 结果 8%PMBE组ADTO及PADTO显著低于乙醇组(P<0.05),但与氟保护漆组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4%PMBE组ADTO及PADTO显著低于1%，2%PMBE组及乙醇组,但显著高于8%PMBE组。扫描电镜见乙醇组牙本质表面牙本质小管完全开放,管壁疏松;氟保护漆组牙本质小管完全封闭;PMBE组管壁胶原基质清晰可见、致密,小管口封堵程度随PMBE浓度增高而增加,8%PMBE组小管口基本完全封堵,剖面可见封堵物。 结论 PMBE乙醇溶液局部涂布使用具有稳定胶原基质和封闭牙本质小管的双重功效,8%PMBE溶液效果最佳,PMBE具备一定治疗牙本质过敏的作用。

马尾松树皮提取物; 牙本质过敏; 牙本质小管; 氟保护漆

牙本质过敏症是指牙齿在受到冷热等温度、酸等化学物质以及机械作用摩擦或咬硬物等所引起的一种异常酸痛症状,具有发作迅速、疼痛尖锐、时间短的特点,好发于老年患者,严重影响患者身心[1,2]。目前普遍接受的牙本质发生的机制是外界刺激作用于开放的牙本质小管,并将刺激传递至近髓处作用于牙髓神经导致的疼痛[2]。因而,封闭牙本质小管是治疗牙本质敏感的根本措施之一[2,3]。

马尾松树皮提取物(pinus massoniana bark extract,PMBE)是从我国广泛分布的松科植物马尾松中提取的天然物质,其含有原花青素(procyanidins, PA)、儿茶素及表儿茶素等多酚类物质及钼、钙等微量元素,其中PA可达90%,具有抗炎、抗肿瘤等多种功能[4-7]。PMBE已被课题组前期通过显微CT及理化性能分析证实可增强牙本质抗酸能力,抑制根面牙本质脱矿,从而具备预防牙本质过敏和根面龋的作用[8]。本研究拟采用PMBE乙醇溶液涂布处理因脱矿所致牙本质小管开放的牙本质,通过扫描电镜及形态计量学观察易于临床局部应用的PMBE乙醇溶液对开放牙本质小管的封闭效果及对脱矿牙本质基质的稳定作用,进一步为其治疗牙本质过敏提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

PMBE(其中PA>95%,奥赛生物科技有限公司,西安),无水乙醇(分析纯,西安化学试剂厂),37%磷酸凝胶(DenFilTM,韩国),柯伯脂氟保护漆(PULDENT®,美国Puldent公司,美国),以无水乙醇为溶剂配制1%,2%,4%,8%的PMBE溶液,取上清液备用。

慢速切割机(UNIPOL-830,科晶有限公司,沈阳),场发射扫描电镜(FESEM S-4800,Hitachi,日本),分析天平(塞多利斯,塞多利斯斯泰帝公司,德国)。

1.2 试样制备

西安交通大学口腔医院新近拔除的无病变隐裂第三磨牙(均来源于20-30岁患者)30颗,去净软组织,垂直于牙长轴截取2 mm厚的冠方牙本质片,进一步将其制备为宽3 mm×长4 mm的牙本质块,2块/牙,共60块。每个试件近咬合面侧用碳化硅砂纸流水下打磨平整,近髓腔面制备一垂直于牙片深约1.7 mm的引导沟,以便于劈开牙本质片观察牙本质剖面形态。

1.3 分组及处理

将60个试件随机分到6个组:乙醇组,氟保护漆组,1%,2%,4%,8% PMBE组,每组10个,其中乙醇组和氟保护漆分别作为阴性和阳性对照组。

试件经超声清洗干净后用37%磷酸凝胶酸蚀30 s,蒸馏水冲洗3次,10 s/次,气枪轻吹去除多余水分,分别用小毛刷蘸取无水乙醇、氟保护漆,1%,2%,4%,8% PMBE乙醇液均匀涂刷2层,自然干燥。

1.4 表面及剖面形貌观察

样本自然干燥后,沿制备的引导沟劈开分为两半,其中一半用于观察牙本质表面特征,另一半用于观察样本的纵剖面。样本喷金,FE-SEM扫描电镜观察表面牙本质小管封堵情况以及剖面牙本质小管管壁形貌;每个试样表面和剖面分别采集3张图像。

1.5 牙本质小管开口面积、开口相对面积和小管封闭深度测定

采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件,对牙本质表面和纵剖面图像分别进行测量分析。导入采集图像,牙本质表面测量牙本质小管开口面积(area of dentin tubule openings,ADTO),剖面测量牙本质小管封堵的深度(sealed depth, SD),每个样本结果为3张图像测量的平均值。按照如下公式计算牙本质小管开口放相对面积(percentage area of dentin tubule openings,PADTO),PADTO=(ADTO/牙本质面积)×100%。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 表面及剖面形貌

乙醇组牙本质表面所有小管口均呈圆形或类圆形开放(见图1A),剖面见牙本质小管清晰可见,管壁较疏松且夹杂空隙,胶原纤维断裂(见图2A);氟保护漆组牙本质表面基本被膜状物覆盖,牙本质小管口完全封闭(见图1B);剖面见管壁内及其管间牙本质均被覆厚薄不一的膜状物,管腔内无明显的树脂突形成(见图2B)。

各PMBE组牙本质表面牙本质小管不同程度封闭,小管口封闭程度随PMBE浓度增加而增大,但仅有8%剖面见小管内有封堵物,长约2-3 μm(见图1)。1%PMBE和2%PMBE组牙本质表面致密,小管边缘可见膜状物形成,小管口较乙醇组减小(见图1);剖面见管壁致密,似有薄层物质覆盖,管壁和管间胶原纤维较清晰(见图2)。4%PMBE组表面牙本质表面呈致密颗粒状,部分小管口被封堵,其余小管开口明显减小,剖面形貌与2%相似(见图1E);8%PMBE组表面牙本质小管基本完全封闭且部分小管口轮廓可见,仅个别牙本质小管未完全封堵(见图1F),剖面见牙本质小管内径较其余组明显缩小,且自管口向下约2-3 μm长度的管腔完全封堵,管壁及管间牙本质均致密,未见明显的胶原纤维暴露(见图2F)。

A-F分别为乙醇组，氟涂膜组，1%PMBE组，2%PMBE组，4%PMBE组，8%PMBE组;图中白箭头示牙本质小管开口图1 牙本质表面微观形貌 (FE-SEM,×5 000)Figure 1 Micro morphology of dentin surface in different groups (FE-SEM,×5 000)

2.2 ADTO,PADTO结果

ADTO乙醇组最大,乙醇组ADTO及PADTO显著高于氟保护漆组,差异有统计学意义(P<0.05);1%PMBE和2%PMBE组ADTO及PADTO均低于乙醇组,但组间差异均无统计学意义(P>0.05);8%PMBE组ADTO及PADTO略高于氟保护漆组,差异无统计学意义(P>0.05);4%PMBE组ADTO及PADTO显著低于2%PMBE组,且显著高于8%PMBE组,差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。

组别ADTO(μm)PADTO(%)乙醇组 321157±62478 2950±574 氟保护漆组 001±003∗ 000±000∗1%PMBE组277857±46419#△2552±426#△2%PMBE组241853±55354#△2221±509#△4%PMBE组106430±27709∗# 978±255∗#8%PMBE组21179±4410∗195±040∗

与乙醇组比较,*P<0.05;与氟保护漆组比较,#P<0.05;与4%PMBE比较,△P<0.05

3 讨论

牙本质过敏症根本上是牙本质暴露,牙本质小管开放所致的牙齿敏感症状[1,2]。目前临床上可用激光、树脂或氟化钠、钾盐等药物的方法,通过直接的神经抑制或改变神经冲动来降低敏感性或机械地封闭牙本质小管来降低牙本质通透性并阻止小管液的流动从而防治牙本质过敏[1-3,9-13]。氟保护漆因含有效成分氟已被用于牙本质过敏和龋齿的预防治疗[13]。氟保护漆是以树脂为基质的含氟缓释剂,能在口腔内快速成膜,并持续释放氟离子的有机溶液,对牙体组织具有良好保护作用[13]。本实验以NaF作为主要有效成分的柯伯脂氟保护漆作为对照观察富含天然交联剂PA的PMBE封闭因酸脱矿而开放的牙本质小管的功效,为防治牙本质过敏提供一定的实验参考。本实验也观察到柯伯脂含氟涂膜能在牙本质表面形成一层致密膜状物从而阻止外界的刺激传入,并具有较强渗透性可进入脱矿的管间牙本质胶原纤维间,但无明显树脂突形成。

PMBE是松科植物马尾松的树皮中提取出的天然物质,富含由单聚体、寡聚体及多聚体组成的PA[4,5]。PA具有抗氧化、抗菌、抗过敏、抗炎镇痛及调节免疫等多种生物学活性[6,14]。葡萄籽等来源的PA也被用于脱矿牙本质和抗致龋菌研究,Gregoire等[15]和毕玲[16]发现PA直接抑制变形链球菌、远缘链球菌等致龋菌活性,还可稳定胶原基质而影响矿化平衡,从而相对减少龋损深度和矿物损失量。可可、葡萄籽等不同来源的PA可通过氢键、离子键、共价键等与胶原相互作用,不同程度地增加胶原交联度,提高胶原强度和耐酶解能力,提高牙本质粘接稳定性[17-21]。课题组前期研究表明,PMBE以及与之同源的马尾松针提取物经pH循环短暂预处理,可抑制根面牙本质钙离子逸出,延缓矿物密度减低,预防牙本质过敏和根面龋[8,22]。

本实验以无毒、渗透性好、易挥发的无水乙醇作为溶剂配制PMBE溶液,以期将PMBE乙醇溶液作为涂布剂或含潄剂局部应用于口腔。实验结果显示4%PMBE组和8%PMBE组ADTO及PADTO显著低于乙醇组,提示PMBE可有效封闭暴露牙本质的小管开口。FE-SEM结果也证实了该结论。8%PMBE组ADTO及PADTO高于氟保护漆组,但两者间的差异无统计学意义,结合FE-SEM结果则提示8%浓度的PMBE乙醇溶液的小管即刻封闭效果与氟保护漆相当,因而治疗牙本质过敏效果最佳。此外,FE-SEM剖面形貌见1%,2%PMBE组管壁较乙醇组致密,管间和管壁胶原纤维较清晰,提示PMBE与葡萄籽提取物一样具有稳定胶原的作用[18,19],其结果可能与PMBE富含PA有关。

PMBE封闭牙本质小管和稳定胶原纤维的作用可能与以下几方面因素有关:①PMBE富含PA[4,5,8],其可通过共价键、离子键、氢键等与脱矿的胶原纤维作用,增加交联度,从而保持了胶原纤维完整;②本实验所用溶剂采用的是无水乙醇,其具有渗透性强、挥发快等特点,该特点可使PMBE乙醇溶液能快速渗透至脱矿的牙本质基质中,PA使裸露的胶原快速交联,乙醇快速挥发后的有形物质覆盖于牙本质表面,从而使该组牙本质小管壁致密甚至封堵牙本质小管口;③原花青素B环上酚羟基还可螯合因酸蚀脱矿胶原纤维间残余的钙离子[8,21,23],从而沉积于牙本质表面;④PMBE组还含有微量的钙元素和钼元素[8],其也可沉积脱矿牙本质表面;⑤PMBE浓度越大,单位体积内的有效成分PA含量越多,上述作用就越大,从而使低浓度1%,2%PMBE乙醇溶液较无水乙醇明显保存了胶原纤维,并使管壁致密,而高浓度4%及8%组则进一步使牙本质小管封堵。本实验中8%PMBE组还观察到封堵物进入管腔且完全封堵约2-3 μm,表明8%PMBE组可能还有一定的耐磨损性。口腔中的材料或修复体还要经受刷牙及自然磨耗等过程,然而本实验仅仅就不同浓度PMBE的即刻封堵效果做了观察,其耐磨损性还有待进一步研究。

本实验证实PMBE乙醇溶液涂布处理具备稳定胶原基质和封闭牙本质小管的双重功效。低浓度PMBE溶液仅具备明显的稳定胶原作用,4%及以上浓度还具备封闭牙本质小管的效能,8%PMBE溶液效果最佳,PMBE具备一定治疗牙本质过敏的作用。

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Effectsofpinusmassonianabarkextractondentinmatrixstabilizationanddentintubuleocclusioninvitro

TANG Chengfang1,ZENG Hui1,ZHANG Sha1,WANG Danyang1,YANG Liyan2,XIE Na1

(1DepartmentofStomatology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2DepartmentofPharmacy,Xi’anMedicalUniversity)

ObjectiveTo investigate the effect of pinus massoniana bark extract(PMBE) on dentin matrix stabilization and dentin tubule occlusion, and provide an experimental basis for the application of PMBE in treatment of dentin hypersensitivity.MethodsSixty dentin blocks were prepared and randomly divided into 6 groups(n=10): alcohol group, fluoride vanish group, 1% PMBE group, 2% PMBE group, 4% PMBE group and 8%PMBE group. The dentin blocks were etched to open the tubules with 37% phosphoric acid in each group, and then treated with absolute alcohol, fluoride vanish, 1%, 2%, 4% and 8%PMBE ethanol solution, respectively. The micro morphology of dentin surface and profile were observed using field emission scanning electron microscope(FESEM), and the area of dentin tubule openings(ADTO), percentage area of dentin tubule openings(PADTO) and sealed depth(SD) were also measured.ResultsThe ADTO and PADTO in 8%PMBE group were significantly lower than that in ethanol group(P<0.05), but there was no significant difference between 8% PMBE group and fluoride vanish group(P>0.05). The ADTO and PADTO in 4% PMBE group were lower than those in 1%, 2% PMBE and ethanol group, and higher than that in 8% PMBE group(P<0.05). The dentin tubules were opened completely in ethanol group, and the walls of tubule were looser. The dentin tubules of dentin surface were sealed completely in fluoride vanish group. The collagen matrix along the tube wall was clear and dense in PMBE groups, and the sealing degree of dentin tubule increased with the increase of PMBE concentration, and the dentin tubules of dentin surface were sealed almost in 8% PMBE group and some sealing substances were seen in profile.ConclusionLocal application of PMBE ethanol solution may stablize the dentin matrix and close the dentin tubules, and 8% PMBE could achieve a better effect of sealing dentin tubules. PMBE has certain therapeutic effects on dentin hypersensitivity.

pinus massoniana bark extract; dentin hypersensitivity; dentin tubule; fluoride vanish

国家自然科学基金资助项目(81641150)；陕西省科技厅社会发展项目(2015SF242)；西安医学院博士启动基金资助项目(2015DOC20)

唐成芳,女,1977-12生,博士,副教授,E-mail:tangchengfang@sohu.com

2017-07-10

R781.2

A

1007-6611(2017)11-1160-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.015