急性白血病源浆细胞样树突状细胞的功能及TLR7、TLR9的表达

段丽芳,范建伟,张晓芹

(陕西中医药大学病理生理学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:livina-2007@126.com)

急性白血病源浆细胞样树突状细胞的功能及TLR7、TLR9的表达

段丽芳*,范建伟,张晓芹

(陕西中医药大学病理生理学教研室,咸阳 712046;*通讯作者,E-mail:livina-2007@126.com)

目的 通过观察急性白血病(AL)患者外周血浆细胞样树突状细胞(pDCs)的功能及Toll样受体7(TLR7)及TLR9 mRNA的表达变化,探讨pDCs功能缺陷的可能原因。 方法 免疫磁珠分选11例初诊未治急性淋巴细胞白血病(ALL)、13例急性髓细胞白血病(AML)和15例健康对照(正常对照组)外周血pDCs,用CpG ODN 2216刺激外周血pDCs,收集细胞培养上清液,ELISA检测上清液IFN-α、TNF-α、IL-6水平;real-time PCR检测pDCs TLR7 mRNA、TLR9 mRNA表达。 结果 AML组和ALL组pDCs产生的IFN-α、TNF-α、IL-6水平均明显低于正常对照组(P<0.05),pDCs功能明显下降;AML组和ALL组pDCs内TLR7 mRNA、TLR9 mRNA亦明显低于正常对照组(P<0.05)。 结论 急性白血病源pDCs内TLR7 mRNA、TLR9 mRNA表达减少,可能进一步抑制pDCs功能,是AL发病机制之一。

急性髓细胞白血病; 急性淋巴细胞白血病; Toll样受体7; Toll样受体9; 浆细胞样树突状细胞

急性白血病(acute leukemia,AL)作为血液系统常见的恶性克隆性疾病,目前主要的治疗手段仍是化疗,尽管单纯放化疗后初诊患者完全缓解(CR)率可达到70%-80%,但其中约60%患者不可避免地面临复发,因此复发是目前白血病治疗中的难题[1]。复发的根源是化疗不能根除体内所有的白血病细胞,即使骨髓及血液查不到明显的白血病细胞,骨髓原始细胞<5%,但体内白血病细胞总数仍有107-109个,称微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)[2]。免疫治疗通过活化吞噬细胞、NK细胞等功能,增细胞胞因子的分泌,重塑机体免疫系统,增强抗肿瘤能力,同时有效清除MRD,降低复发率,成为白血病继化疗后又一重要的治疗手段。浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)是DC的一个重要亚型,活化后通过产生大量IFN-α,进一步激活NK细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞等增强抗肿瘤能力,且自身逐步成熟向树突状细胞(dendritic cells,DCs)分化,而在连接固有免疫和适应性免疫中发挥着重要作用[3]。而pDCs的功能与其表达的Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)及TLR9密切相关[4]。已有研究证实,AL患者体内pDCs数量减少,伴功能缺陷[5],但对pDCs功能缺陷原因未进一步探讨。本研究通过分离AL源外周血pDCs,观察pDCs内TLR7及TLR9的表达,探讨pDCs功能缺陷的原因。

1 材料与方法

1.1 实验对象

急性白血病患者外周血单个核细胞取自陕西中医药大学附属医院血液科,2013-02～2014-02收治的24例初诊白血病患者,其中急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者13例(M01例、M25例、M32例、M44例、M51例),急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)患者11例;年龄2-60岁,中位年龄34岁。诊断符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[6]。健康志愿者15例,年龄8-65岁,中位年龄37岁。

1.2 主要试剂

RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品,胎牛血清购自为杭州四季青生物工程公司,Ficoll-hypaqu购自北京索来宝生物科技有限公司,CpG ODN-2216购自上海生工生物工程技术服务有限公司。大鼠抗人BDCA-4免疫磁珠为德国美天旎生物技术公司产品,小鼠抗人BDCA-2、小鼠抗人CD123单克隆抗体购自为荷兰Hycult公司,RNA提取试剂、反转录及实时定量PCR试剂购于大连TaKaRa公司,IFN-α ELISA试剂盒(3.9 pg/ml)、IL-6 ELISA试剂盒(灵敏度0.7 pg/ml)及TNF-α ELISA试剂盒(灵敏度5 pg/ml)均为美国R&D公司产品。

1.3 pDCs的分选

外周血单个核细胞(PBMCs)分离:收集AML、ALL患者及健康志愿者外周血20 ml(肝素抗凝),PBS液稀释,等体积Ficoll-hypaqu行密度梯度离心,收集单个核细胞,液氮保存备用。pDCs分选:常规复苏冻存的PBMCs,用RPMI 1640调整细胞密度至1×109/L,加小鼠抗人BDCA-2、小鼠抗人CD123单克隆抗体单抗,经细胞磁珠分选系统分离获得pDCs,检测其纯度为93%,存活率为92%。

1.4 ELISA检测外周血pDCs释放的IFN-α、TNF-α及IL-6的含量

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整pDCs密度为1×106/L,接种于48孔培养板(500 μl/孔),加入CpG ODN 2216(终浓度为6 μmol/L),共刺激24 h,收集上清,按ELISA试剂盒说明书检测各组IFN-α、TNF-α及IL-6含量,显色后酶标仪检测450 nm波长OD值,绘制标准曲线,并根据曲线计算上述细胞因子含量。

1.5 real-time PCR检测pDCs内TLR7 mRNA及TLR9 mRNA的表达

应用Primer Express软件(PE Biosystems)设计基因特异性PCR引物序列,TLR7上游引物为:5′-TTCAACCAGACCTCTACATTCCATT-3′,下游引物为:5′-GCAGTCCACGATCACA TGGTT-3′;TLR9上游引物为:5′-CCGTGACAATTACCTGGCCTTC-3′,下游引物为:5′-CAGGGCCTTCAGCTGGTTTC-3′;β-actin上游引物为:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游引物为:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3′。按试剂的操作步骤提取pDCs总RNA、逆转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR,反应条件(25 μl体系),SYBR Premix Ex Taqtm II 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl,cDNA(20 mg/L)2 μl,dH2O 8.5 μl。扩增条件:预热50 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30s,共40个循环;以CT表达目的基因的相对表达量。

1.6 统计学分析

所有数据均以均数±标准差(Mean±SD)描述,采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理。各组间采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pDCs细胞IFN-α、TNF-α、IL-6的表达水平

经CpG ODN刺激后,不同组pDCs细胞上清中IFN-α、TNF-α、IL-6分泌水平差异明显:AML和ALL患者外周血pDCs产生的IFN-α、TNF-α、IL-6的水平均明显低于正常对照(P<0.05)。AML和ALL组间相比无显著性差异(见图1)。

2.2 TLR7 mRNA及TLR9 mRNA扩增曲线

用ABI7500定量PCR仪分析各组外周血pDCs内TLR7 mRNA及TLR9 mRNA表达,扩增曲线见图2。

2.3 pDCs内TLR7 mRNA及TLR9 mRNA表达水平

实验结果表明:白血病组和正常对照组pDCs中均有TLR7 mRNA、TLR9 mRNA的表达,白血病组外周血pDCs内TLR7 mRNA及TLR9 mRNA的表达均明显低于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。AML和ALL组间差异无统计学意义(见图3)。

与control组比较,#P<0.05图1 各组pDCs表达的IFN-α、IL-6、TNF-α水平Figure 1 The concentration of cytokines in the supernatant of pDCs with AL

A. TLR7 mRNA B. TLR9 mRNA 图2 Toll样受体7及9扩增曲线Figure 2 Amplification curves of the mRNA expression of TLR7 and TLR9

与control组比较,#P<0.05图3 白血病组及正常对照组TLR7及TLR9的mRNA表达Figure 3 The mRNA expression of TLR7 and TLR9 in AL group and control group

3 讨论

1958年,Lennert和Remele在活动性淋巴结周围发现pDCs,因其形态与浆细胞相似,故将其命名为浆细胞样单核细胞,后来研究证实这类细胞可向成熟DC分化,又将其命名为pDCs[7]。在病毒等刺激下,pDCs可产生大量IFN-α及其他细胞因子,参与免疫应答。其中,IFN-α可抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,已被用于肿瘤及白血病治疗中。pDCs通过诱导初始T细胞向Th2方向分化、活化B细胞、激活NK细胞等方式调节免疫应答,在固有免疫及适应性免疫中均发挥重要作用[3]。随着对pDCs功能的深入研究,越来越多的证据提示,pDCs的功能与疾病的发生发展密切相关。研究发现,在HIV感染、慢性乙型肝炎甚至实体瘤中均可见到pDCs数量减少伴功能缺陷,提示pDCs与多种疾病的发病和预后密切相关[8-10]。

前期研究已经证实慢性粒细胞白血病患者外周血pDCs分泌的细胞因子数量明显减少,缓解期则明显好转,提示pDCs功能缺陷参与慢性粒细胞白血病发病[11]。本实验结果显示:急性髓细胞白血病(AML)及急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血pDCs分泌的IFN-α、TNF-α、IL-6水平均明显下降,提示pDCs功能缺陷可能参与白血病发病。pDCs功能缺陷,不能产生足够的细胞因子,造成B细胞活化障碍,影响体液免疫,同时诱导成熟DC减少,NK细胞活化功能障碍,T细胞极化受到影响不能发挥正常的细胞免疫,引起免疫微环境紊乱,抗肿瘤免疫能力下降,造血干细胞恶克隆性增生。

pDCs分泌大量的细胞因子与其表面的模式识别受体有关。研究证实,pDC选择性表达TLR7和TLR9模式识别分子[12]。TLR7/9识别配体后,通过TIR募集下游的关键分子MyD88,磷酸化IRAK,与TRAF6结合,IRAKs/TRAF6复合物联合TAK1激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)[4]。此外,IRAKs/TRAF6复合物激活干扰素调节因子7(IRF7)活化pDCs[13]。在pDC早期内体,A型CpG DNA激活TLR9后触发IRF7介导的信号级联反应,导致IFN-I释放。B型CpG DNA激活TLR9后,在晚期内体激活NF-κB/MAPKs信号级联反应,释放TNF-α和IL-6。其中TNF-α提高pDCs抗原提呈作用的同时,上调MHC-Ⅰ类分子的表达,促进DC成熟;IL-6联合IFN-α则可以诱导B细胞成熟,增强固有免疫应答[14];还可促使T细胞向Th2分化,活化NK细胞增强其抗肿瘤能力,提高获得性免疫应答[12]。TLR7及TLR9下调可减弱对病原体的易感性和特异性免疫[15]。

徐宁等[16]研究揭示,慢性乙型肝炎患者体内pDCs内TLR7及TLR9表达下降是pDCs功能缺陷的主要原因,参与疾病进展。我们前期研究也发现慢性细胞白血病源pDCs内TLR7及TLR9表达亦导致pDCs功能缺陷。本实验还观察到,AL患者外周血pDCs功能下降的同时,伴TLR7及TLR9表达下调。TLR7及TLR9是pDCs活化的重要的模式识别受体,AL患者体内造血微环境及免疫微环境的改变,导致TLR7及TLR9表达减少,pDCs功能缺陷,不能激活下游的信号转导途径,分泌的细胞因子减少,导致DCs、NK细胞及效应T细胞功能紊乱,对Treg的抑制作用减轻,影响固有免疫和适应性免疫的功能,促使AL细胞克隆性生长。研究结果提示TLR7及TLR9表达减少可能是pDCs功能下降的重要原因。因此,通过提高TLR7及TLR9表达,重建pDCs的功能及相应的免疫网络,恢复机体原有的免疫状态,使微小残留病灶处于休眠期状态而有望成为潜在治疗手段。

综上,急性白血病进展中pDCs数量减少,分泌的细胞因子减少,造成免疫功能紊乱,参与AL发病促进AL进展;pDCs功能缺陷与TLR7及TLR9表达减少有关。本研究结果证实了AL源pDCs功能缺陷的主要原因,为以pDCs为靶点的生物免疫治疗提供实验依据。

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ThefunctionofplasmacytoiddendriticcellsandtheexpressionofTLR7mRNAandTLR9mRNAinacuteleukemia

DUAN Lifang*,FAN Jianwei,ZHANG Xiaoqin

(DepartmentofPathophysiology,ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046，China;*Correspondingauthor,E-mail:livina-2007@126.com)

ObjectiveTo explore the causes of plasmacytoid dendritic cells(pDCs) dysfunction by observing the function of pDCs and Toll-like receptor 7(TLR7) mRNA and TLR9 mRNA expression in patients with acute leukemia(AL).MethodsThe peripheral blood pDCs from 11 patients with untreated acute lymphocytic leukemia(ALL), 13 patients with acute myeloid leukemia(AML) and 15 healthy controls(normal control group) were sorted by immune magnetic beads. After the pDCs were cultured with CpG ODN 2216, the supernatants were collected to detect the levels of IFN-α, TNF-α and IL-6 in supernatants by ELISA and the expression of TLR7 mRNA and TLR9 mRNA in pDCs by real-time PCR.ResultsThe levels of IFN-α, TNF-α and IL-6 produced by pDCs were significantly lower in patients with AML and ALL than those of normal controls(P<0.05), and the pDCs function significantly decreased. Compared with controls, the mRNA expression of TLR7 and TLR9 in pDCs was significantly decreased in AML and ALL patients(P<0.05).ConclusionThe expression of TLR7 mRNA and TLR9 mRNA in pDCs of AL decrease, which further inhibits the function of pDCs and promote the pathogenesis of AL.

acute myelocytic leukemia; acute lymphoblastic leukemia; Toll like receptor 7; Toll like receptor 9; plasmacytoid dendritic cells

陕西省教育厅科学研究项目(14JK1191);陕西中医药大学科研创新基金项目(2015QN06)

段丽芳,女,1986-01生,硕士,讲师,主治医师,E-mail:livina-2007@126.com

2017-06-30

R733.7

A

1007-6611(2017)11-1141-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.011