99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在荷瘤鼠体内分布和显像的研究

解 朋，黄建敏，刘晓梅，魏玲格

（河北医科大学第三医院核医学科，河北 石家庄 050051）

◁腹部影像学▷

99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在荷瘤鼠体内分布和显像的研究

解 朋，黄建敏，刘晓梅，魏玲格

（河北医科大学第三医院核医学科，河北 石家庄 050051）

目的：制备99Tcm标记MAG3-isoDGR-2C小分子多肽，探讨其作为ανβ3靶向新型分子显像剂的可能性。方法：利用葡庚糖酸盐（Glucoheptonate，GH）转换络合法进行99Tcm对MAG3-isoDGR-2C的标记；将S180荷瘤鼠采用随机抽样法分为5组，每组5只，分别于注射99Tcm-MAG3-isoDGR-2C 30 min，60 min，120 min，240 min和360 min后断头处死，计算各脏器放射性摄取（%ID/g）、肿瘤/血液（T/B）和肿瘤/肌肉（T/M）摄取比值。取荷瘤鼠5只，在注射后不同时间点分别进行SPECT显像，并利用勾画感兴趣区技术计算T/NT的比值。结果：利用转换络合法能够成功的进行标记99Tcm-MAG3-isoDGR-2C，放射化学纯度能够达到94.34%，放射性比浓度10.93 MBq/mL且无需纯化；荷瘤鼠体内分布显示该标记物能够较快的从血液中清除，主要经肾脏排泄，心脏、肺、脾脏、胃、骨骼等组织的放射性摄取均很少，而肿瘤组织具有一定的放射性摄取，在4 h T/B和T/M摄取比值分别为1.75和10.50；注射99Tcm-MAG3-isoDGR-2C后2 h SPECT显像可见肿瘤组织显影最清晰，T/NT比值为3.24±1.71。结论：99Tcm-MAG3-isoDGR-2C标记方法简便、易行、标记率高，对恶性肿瘤具有一定的靶向性，有潜力成为一种新的分子显像剂。

肿瘤，实验性；动物，实验；鼠科；体层摄影术，发射型计算机，单光子；99m锝甲氧基异丁基异腈

恶性肿瘤的发病率和病死率逐年增加，目前恶性肿瘤已经成为了威胁人类健康的重要 “杀手”，如果能够对恶性肿瘤进行早期的诊断和治疗，则可能明显改善恶性肿瘤的预后，因此采用何种办法能够对恶性肿瘤进行早诊断和早治疗是目前临床面临的难点，也是研究的热点。在肿瘤新生血管中整合素ανβ3（Integrin ανβ3）高度表达，但是在正常血管中则低表达或不表达，因此以整合素ανβ3为靶点，研究者做了很多研究，也取得了一定的成果。其中小分子肽精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）具有与整合素ανβ3特异性结合的能力，目前大量的研究将放射性核素131I、99Tcm等对RGD及其衍生物进行标记，针对恶性肿瘤进行靶向治疗或显像，研究结果显示出了其较好的优越性和潜在的应用价值[1-4]。小分子肽天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（NGR）中的天冬酰胺能够通过脱酰胺作用而形成isoD（异天冬氨酸，isoAsp），从而使NGR转化为isoDGR，转化后的小分子多肽能够特异性识别整合素ανβ3并与其结合[5]。本研究采用转换络合法进行放射性核素99Tcm标记isoDGR为核心区域的小分子多肽，研究其在S180荷瘤小鼠的体内生物学分布及荷瘤鼠的SPECT显像，为其进一步在恶性肿瘤患者中的应用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

99Tcm-99Mo发生器由原子高科股份有限公司提供；MAG3-isoDGR-2C委托北京中科亚光生物科技有限公司合成，纯度为97.03%；葡庚糖酸盐（GH）（药盒、乙腈（0.1%TFA）、薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）聚酰胺-生理盐水/乙腈由北京师范大学化学系提供）；Balb/c小鼠，雄性，20～25 g，共30只，清洁级，体质量18～20 g，北京大学动物部提供；FM-2000锝分析仪，西安凯普机电有限责任公司；Waters 500 TR液相色谱仪，美国Waters 2489 UV/Visible Detector；FJ-391型同位素活度计，北京核仪器厂；双探头SPECT仪，美国GE公司产，型号：Infinia Hawkeye。

1.2 多肽的标记

在 GH 药盒中加入 1mL Na99TcmO4（240.5MBq），摇匀后室温放置15 min后即得到99TcmO-GH中间体。向2 mL离心管中加入10 μL多肽溶液，200 μL缓冲液HAc-NaAc（pH=4.6），加入制备好的99TcmOGH 中间体 10 μL（2.405 MBq），充分摇匀后 100℃反应15 min。采高效液相色谱法（HPLC）进行放射化学纯度的鉴定，流动相为：A相：H2O （0.1%TFA），B相：乙腈（0.1%TFA），保留时间为 0，17，19，21 和26 min，流动相 B（%）为 0，17，50，100，0。并将标记好的放射性药物于人血清37℃，放置30，60，120，240及360 min后分别测定其放射化学纯度，以观察其体外稳定性。

1.3 荷瘤鼠模型的建立

①肿瘤细胞悬液的制备：将S180肉瘤细胞株复苏后，接种于昆明小鼠腹腔，培养8～10 d后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。②肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95%。③肿瘤细胞接种：腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1×107mL-1，在小鼠右侧腋下常规接种S180瘤液各0.2 mL/只（含2×106个瘤细胞）。将小鼠培养1周至肿瘤的平均直径约为1 cm，即得到荷S180肉瘤小鼠模型。

1.4 荷瘤鼠体内的生物学分布

按随机抽样法选取荷瘤鼠25只，分为5组，每组5只。尾静脉注射0.1 mL（7.03 MBq）99Tcm-MAG3-isoDGR-2C溶液。分别于注射后30 min，60 min，120 min，240 min和360 min后断头处死，收集心脏、肝脏、肾脏、肿瘤、肌肉、血液和其他感兴趣组织和器官，擦净后称重并测定放射性计数，结果经参考源校正后以%ID/g表示，表示为mean±SD，并计算肿瘤与血液（T/B）和肿瘤与肌肉（T/M）比值，并取少量肉瘤组织行病理检查，确定为S180肉瘤。

1.5 荷瘤鼠的SPECT显像

首先准备好模型建立成功的荷瘤鼠5只，通过尾静脉注射 0.1 mL（9.62 MBq）99Tcm-MAG3-isoDGR-2C，显像过程中，荷瘤鼠用质量分数1.5%的异氟烷吸入麻醉，固定在SPECT仪准直器视野中央。显像条件：配通用型平行孔准直器，能峰140 keV，窗宽20%，矩阵256×256，采集时间5 min。显像结束后，以所有显影的肿瘤组织（右侧腋下）和左侧腋下相对应的区域为感兴趣区（ROI），使用ROI技术计算不同时间点T（肿瘤区域）和NT（左侧腋下相对应的区域）的放射性摄取计数，为了保证T与NT包含的像素多少一致，在勾画完肿瘤后，采用复制粘贴的方法，勾画并计算左侧腋下相应区域的放射性摄取计数，并计算T/NT放射性摄取比值行半定量分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化学纯度

99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化学纯度为（94.34±2.16）%（图1），无需进行纯化，浓度为10.93 MBq/mL，人血清稳定学研究显示能够在人血清中稳定，360 min后仍能保持在85%以上 （图2）。因此，该标记物可以进行后续的体内分布和显像的研究。

2.2 荷瘤鼠体内的生物学分布

图1 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的HPLC图。Figure 1.HPLC map of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C.

图2 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在人血清中的稳定性。Figure 2.Serum stability of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C.

经病理学确证，肿瘤组织为S180肉瘤（图2）。体内生物学分布 （表1）示静脉注射99Tcm-MAG3-isoDGR-2C后，血液中的放射性摄取下降很快，30min时荷瘤鼠血液放射性最高为 （1.10±0.15）%ID/g，240 min 时下降到（0.12±0.002）%ID/g；而排泄器官肾脏的放射性分布最高，但是下降较快，30 min时肾脏放射性最高为（4.59±0.50）%ID/g，240 min 时下降到（1.39±0.04）%ID/g；肿瘤组织的放射性摄取也随时间延长而逐渐降低，30 min时肿瘤组织放射性最高为 （0.80±0.14）%ID/g，240 min 时下降到 （0.21±0.03）%ID/g；而其余组织骨骼、肌肉、脾脏等放射性分布较低且清除较快；但T/B和T/M比值随时间逐渐增高，240 min时最高，分别为1.75和10.50。

表1 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在S180荷瘤鼠体内的生物学分布（±s，n=5）

表1 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在S180荷瘤鼠体内的生物学分布（±s，n=5）

注射后时间30 min 60 min 120 min 240 min 360 min心脏 0.33±0.05 0.12±0.03 0.08±0.02 0.06±0.02 0.04±0.004肝脏 1.84±0.26 1.07±0.14 1.03±0.13 0.70±0.07 0.67±0.08肺 0.77±0.16 0.28±0.02 0.17±0.03 0.10±0.01 0.07±0.009肾脏 4.59±0.50 2.09±0.38 1.64±0.31 1.39±0.04 1.01±0.22脾 0.24±0.07 0.15±0.04 0.08±0.02 0.12±0.06 0.08±0.05胃 0.58±0.16 0.55±0.12 0.48±0.13 0.40±0.07 0.31±0.05骨骼 0.53±0.14 0.23±0.09 0.13±0.05 0.11±0.05 0.04±0.03肌肉 0.25±0.04 0.19±0.11 0.05±0.01 0.02±0.01 0.02±0.03肠道 1.34±0.38 0.77±0.17 0.33±0.10 0.14±0.03 0.06±0.05肿瘤 0.80±0.14 0.57±0.10 0.31±0.05 0.21±0.03 0.13±0.03血液 1.10±0.15 0.36±0.03 0.20±0.04 0.12±0.002 0.10±0.007甲状腺 1.71±0.23 0.78±0.07 0.49±0.27 0.25±0.11 0.25±0.16 T/M 3.20 3.00 6.20 10.50 2.60 T/B 0.73 1.58 1.55 1.75 1.30

2.3 SPECT荷瘤鼠显像

注射99Tcm-MAG3-isoDGR-2C后，SPECT显像示，在显像初期（注射显像剂后30 min）即可见到肿瘤组织显影，随时间延长，逐渐清晰，到120 min时显像最为清晰，此时通过ROI计数得到的T/NT比值最高为3.24±1.71，在240 min时肿瘤组织显影仍然能够看到（图4）。

图3 经病理学验证肿瘤组织S180肉瘤组织（HE）。图4 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C SPECT荷瘤鼠显像（箭头所指为肿瘤）。图4a为注射显像剂后2 h SPECT显像图，图4b为注射显像剂后4 h显像图。Figure 3.Sarcoma tissue in tumor proved by S180(HE)on pathology. Figure 4.99Tcm-MAG3-isoDGR-2C SPECT imaging of tumor-bearing mice(arrow head on the tumor).Figure 4a,4b are SPECT images 2 h and 4 h after tracer administration.

3 讨论

恶性肿瘤新生血管的生成在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等方面都发挥着重要的作用[6]。而恶性肿瘤组织的新生血管不仅数量上远远大于正常组织，约是正常组织的50～200倍，而且肿瘤新生血管在结构、功能以及分子水平等方面都与正常组织的血管存在着较大的差异。因此，肿瘤新生血管已成为肿瘤诊断和治疗的重要靶点[7]。整合素由于具有帮助血管内皮细胞黏附、调控血管内皮细胞的细胞分裂周期、参与内皮细胞的激活和迁徙、介导内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡等[8-9]作用，因此其在肿瘤组织的血管生成中发挥着重要作用。整合素ανβ3是由α亚基（相对分子质量为 120 000～185 000）和β亚基（相对分子质量为90 000～110 000）两个亚单位形成的异二聚体跨膜糖蛋白，现已发现18种不同的α亚基和8种β亚基，可结合成至少24种整合素，是整合素家族中的重要成员。整合素ανβ3在成熟血管内皮细胞表面低表达或几乎不表达，但在肿瘤新生血管的内皮细胞中则高度表达，甚至过表达，因此整合素ανβ3为靶向的进行恶性肿瘤的诊断和治疗提供了有效的靶点。能够与整合素ανβ3特异性结合的小分子多肽，在肿瘤的早期诊断中展现出了较好的前景，目前已经有研究将68G标记的含RGD的多肽用于人食管癌的研究，研究结果表明该显像剂不仅在FDG浓聚的部位明显显影，甚至在不浓聚FDG的位置找到了新的病灶[10]。动物试验中发现64Cu标记的含RGD的多肽在肿瘤新生血管显像和肿瘤的治疗中都存在潜在的应用前景[11]。

研究表明整合素ανβ3能够特异性识别和结合包含isoDGR序列的多肽[5]，因此本研究使用临床中最常用的放射性核素99Tcm进行标记，在标记前先对isoDGR序列进行了修饰，其中在多肽两端分别加入了一个半胱氨酸是为了保护isoDGR的稳定性,而另外再引入螯合基团MAG3的目的是在不影响其生物学活性的同时更加容易进行99Tcm标记。本研究表明，放射性核素99Tcm能够成功的对MAG3-isoDGR-2C进行标记，而且标记率高达94.34%，而且无需纯化，能够较好的满足试验的要求。荷瘤鼠体内生物学分布表明：肾脏是放射性分布最多的器官，表明99Tcm-MAG3-isoDGR-2C主要经泌尿系统排泄；肝脏和肠道的放射性计数也高于骨骼、心脏等器官，表明该标记物可能会从肝脏代谢经肠道排出，而该分子探针从血液中的清除速度较快，到2 h时血液中仅剩余0.20%ID/g，这有利于显像中放射性本底的降低，有利于得到更加优质的图像；而甲状腺的放射性分布较高，可能是由于该标记物在荷瘤鼠体内不是很稳定，存在一定的脱标情况。肿瘤组织特异性摄取99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在荷瘤鼠体内生物学分布试验中得到了一定程度的验证，T/B和T/NT在4 h时最高，分别为1.75和10.50，这说明肿瘤组织内放射性药物的清除较非肿瘤组织相对缓慢，使得对比差异加大。SPECT显像可以看到肿瘤组织在2 h时清晰的显影，更加直观表明了肿瘤组织对99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的摄取。

以isoDGR为核心模序的多肽能够特异识别和结合整合素ανβ3，因此其在恶性肿瘤的诊断和治疗中存在一定的应用前景，本实验通过对MAG3-isoDGR-2C进行临床最常用的放射性核素99Tcm标记，研究其在荷瘤鼠体内的生物学分布和SPECT显像，结果表明该分子探针具有一定的靶向性，本实验将为包含isoDGR模序的多肽在核素显像和治疗方面更加深入的研究提供一定的实验基础。

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Study of the biodistribution and imaging of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in tumor bearing mice

XIE Peng,HUANG Jian-min,LIU Xiao-mei,WEI Ling-ge
(Department of Nuclear Medicine,the Third Affiliated Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China)

Objective:To study the feasibility of using labeled MAG3-isoDGR-2C with99Tcmas a potential molecular imaging agent for ανβ3 targeting.Method:The MAG3-isoDGR-2C was labeled with99Tcmusing glucoheptonate transformation and complexation.S180 tumor bearing mice were divided into 5 groups with 5 mice each.At 30 min,60 min,120 min,240 min and 360 min after the injection of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C,the mice were sacrificed by decapitating.The biodistribution in the organs,T/B and T/M was calculated.SPECT imaging was performed at different time points after injection in 5 tumor bearing mice,and the ratio of T/NT were calculated by using ROI.Results:The MAG3-isoDGR-2C was labeled with99Tcmeffectively and simply,and the radiation chemical purity could reach to 94.34%without purification.The biodistribution showed the tracer was cleared rapidly from blood and was mainly excreted through kidney.The radioactive uptake in heart,lung,spleen,stomach and bone was low,and the uptake in tumor could be visualized.The maximum ratios of T/B and T/NT were 1.75 and 10.50 respectively in the time of 4 hours after injection of the tracers.The SPECT images demonstrated the increased activity in the region of tumor with the maximum T/NT of 3.24±1.71.Conclusion:99Tcm-MAG3-isoDGR-2C can be made easily and show certain targeting ability to the malignant process,which proves its potentiality to become a new molecular imaging agent.

Neoplasms,experimental;Animals,laboratory;Muridae;Tomography,emission-computed,single-photon;Technetium Tc 99m sestamibi

R73-354；R817.4

A

1008－1062（2017）07－0480－04

2016－11－10；

2016－12－23

解朋（1982-），男，河北易县人，主治医师。E-mail：woxinfly1982@126.com

黄建敏，河北医科大学第三医院核医学科，050051。E-mail：jm_huang2003@126.com

河北省自然科学基金（H2014206286）。