Apelin通过抑制高糖介导的氧化应激保护血管内皮功能

杨维维，马健，马士新，魏鈞伯，方宁远

(1.上海交通大学医学院附属仁济医院老年科，上海 200127；2.上海交通大学附属第六人民医院心内科)

·基础研究·

Apelin通过抑制高糖介导的氧化应激保护血管内皮功能

杨维维1，马健2，马士新2，魏鈞伯2，方宁远1

(1.上海交通大学医学院附属仁济医院老年科，上海 200127；2.上海交通大学附属第六人民医院心内科)

目的探讨Apelin对高糖诱导的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中活性氧(ROS)生成和糖尿病(DM)小鼠内皮依赖性血管功能障碍的影响。方法①体外实验采用高浓度葡萄糖培养基诱导HUVECs细胞损伤，Apelin-13预处理1h后测定细胞内Apelin-13、ROS水平和Caspase-3的活性(ELISA法测定)。②构建1型糖尿病小鼠模型，予Apelin-13干预后，血管张力仪测定主动脉环内皮依赖性血管舒张功能和非内皮依赖性血管舒张功能。结果与对照组相比，高糖诱导后的HUVECs内Apelin-13的含量明显下降(P=0.01)；高糖诱导后HUVECs中ROS生成和Caspase-3的活性增加，而Apelin干预可显著降低高糖诱导的ROS生成和Caspase-3的活性(P=0.03，P=0.04)。此外，与对照组相比，DM小鼠主动脉环内皮依赖性血管舒张功能显著下降(P=0.02)，而Apelin干预可有效地减轻DM小鼠血管内皮功能障碍。结论Apelin抑制高糖诱导的血管内皮细胞活性氧生成和细胞凋亡，减轻DM小鼠血管内皮功能障碍。

糖尿病并发症；内皮,血管；氧化性应激；模型,动物

糖尿病(DM)是当前全世界致死和致残的主要原因之一，血管异常是DM及其相关并发症进展的主要原因[1]，而高糖导致的血管内皮功能障碍已被证实是DM血管病发症的重要原因和始动因素[2]。近年来的研究表明，活性氧(ROS)诱导的氧化损伤在DM内皮功能障碍的发生发展过程中起着关键作用[3-5]，内皮细胞中ROS产物的增加可以与一氧化氮(NO)直接反应，形成更有害的过氧亚硝酸盐(ONOO-)，从而降低NO生物利用度[6]，最终导致内皮细胞凋亡及血管内皮功能障碍的发生。

Apelin作为一种有益的脂肪分子，是血管紧张肽受体样蛋白质J(APJ)的内源性配体。Apelin可以通过不同的信号通路调控糖脂代谢，在DM的发生发展中起着重要的调控作用[7-9]。然而，Apelin能否改善DM引起的血管内皮功能障碍及其可能机制仍尚未明确。因此，本研究通过利用高糖诱导血管内皮细胞模型和DM小鼠模型，观察Apelin对氧化应激和血管内皮依赖性舒张功能的影响，探讨Apelin在DM血管并发症防治中的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 40只雄性小鼠，由上海西普尔-必凯实验动物公司实验动物中心提供(动物编号：SCXK(沪)2013-0016)。原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购于Allcells公司；Apelin-13多肽购于GL Biochem公司；链脲佐菌素(STZ)购于Sigma公司；胎牛血清购于Hyclone公司；DMEM培养基及抗生素购于Gibco 公司；45%葡萄糖液购于Sigma公司；去氧肾上腺素(PE)、乙酰胆碱(Ach)、硝普钠(SNP)均购于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DM小鼠模型的建立及实验分组 40只雄性小鼠普通饲料适应性喂养1周后，其中20只麻醉后，腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)50 mg·kg-1·d-1，连续5 d，最后一次注射STZ 72 h后测血糖，如血糖gt;15.0 mmol/L则确认为1型DM，并采用随机数字表法分为DM组(Con-STZ组，n=10)和Apelin+DM组(Apelin-STZ组，n=10)。另20只小鼠用柠檬酸盐缓冲液进行处理后作为对照组(血糖lt;12 mmol/L)，并随机分为健康对照组(Con组，n=10)和Apelin+对照组(Apelin组，n=10)。Apelin-13通过渗透性微泵持续腹腔给药，3 nmol·kg-1·h-1。

1.2.2 细胞培养及分组 HUVECs株培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清和1%抗生素)中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育。分组处理如下：①对照组(Control组，干预时给予同体积的DMSO)；②Apelin+对照组(Apelin-13多肽预处理1 h后再予DMSO)；③高糖组(HG组，含35 mmol /L的D-葡萄糖DMEM 培养基培养)；④Apelin+高糖组(Apelin-13多肽预处理1 h后再予高糖培养基培养)。干预时间为24 h，Apelin-13浓度为200 nmol/L。细胞种于六孔板中，每组至少重复3 次。

1.2.3 主动脉环检测内皮依赖性和内皮非依赖性血管舒张功能 在预冷并通入95% O2+5% CO2混合气体的Krebs液中剥离出糖尿病小鼠胸主动脉，漂洗后剪成3～4 mm的血管环，连接多个张力传感器；加入PE(10-6mol/L)预收缩动脉环10 min，达峰值后依次加入5 μL 10-9～10-4mol/L的Ach累加计量舒张动脉环，检测内皮依赖性血管舒张功能；再用Krebs液冲洗3次，每次10 min，加入PE(10-6mol/L)预收缩动脉环达峰值后，依次加入5 μL 10-9～10-4mol/L的SNP，累加计量舒张动脉环，检测内皮非依赖性血管舒张功能。

1.2.4 Apelin-13、ROS和Caspase-3的检测 采用酶联免疫法(ELISA)测定Apelin-13的含量，试剂盒购于美国Phoenix pharmaceutical Inc。用荧光探针DCFH-DA检测ROS水平。使用荧光测定试剂盒(购于BIOMOL Research Laboratories)测定细胞内Caspase-3的活性。

2 结果

2.1 高糖对Apelin-13含量的影响 与Con组相比，HG诱导的内皮细胞中Apelin-13的含量明显降低(P=0.01)，见图1。

与Con组比较，aPlt;0.05

2.2 Apelin-13对高糖诱导的血管内皮细胞ROS产生的影响 与Con组相比，HG组的ROS生成明显增加(P=0.03)，Apelin-13干预后能细胞内ROS的生成得到显著抑制(P=0.03)，见图2。

与Con组比较，aPlt;0.05；与HG组比较，bPlt;0.05

图2Apelin-13对高糖诱导的HUVECs内ROS产生的影响

2.3 Apelin-13对高糖诱导引起的血管内皮细胞凋亡的影响 与Con组相比，HG组的Caspase-3活性明显增加(P=0.03)，Apelin-13干预后Caspase-3的活性得到显著抑制(P=0.04)，见图3。

与Con组比较，aPlt;0.05；与HG组比较，bPlt;0.05

图3Apelin-13对高糖诱导引起的HUVECs凋亡的影响

2.4 Apelin-13对DM小鼠主动脉血管舒张功能的保护 主动脉环内皮依赖性血管舒张功能在Con-STZ组明显受损，经Apelin预处理后明显改善(Ach浓度≥10-7mol/L起，P=0.02)；而各组非内皮依赖性血管舒张反应差异无统计学意义(Pgt;0.05)，见图4。

3 讨论

本研究显示：高糖干预后内皮细胞中Apelin-13的含量显著下降，提示Apelin变化可能参与DM血管损伤过程。近年研究发现内皮细胞内ROS生成是DM血管损伤的重要机制[10-12]，本研究同样发现高糖诱导后细胞内ROS生成和Caspase-3的活性增加，而外源性Apelin-13干预后内皮细胞中ROS生成和细胞凋亡得到显著逆转，证实 Apelin-13可能通过抑制内皮细胞中ROS生成、减少细胞凋亡进而发挥血管内皮保护作用。

与Con组比较，aPlt;0.05；n=6

图4Apelin-13对糖尿病小鼠主动脉血管舒张功能的影响

血管内皮是衬于血管壁内的超薄结构，高糖环境下由于ROS生成增加造成内皮细胞损伤、促进炎性反应和血管舒张功能障碍[11-12]。本研究发现，1型DM小鼠存在内皮依赖性血管舒张功能障碍，而Apelin-13可保护DM小鼠的血管舒张功能，改善DM所致的内皮依赖性舒张功能障碍。

综上所述，本研究证实了Apelin-13干预对DM小鼠的血管内皮功能障碍有保护作用，机制与抑制氧化应激和细胞凋亡有关。研究结果将为进一步探索DM血管功能障碍的防治提供理论依据和基础。

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Apelinprotectsendothelialfunctionviainhibitinghighglucose-inducedoxidativestress

YangWeiwei*,MaJian,MaShixin,WeiJunbo,FangNingyuan

(*DepartmentofGeriatrics,RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

FangNingyuan,Email：fangny@sh163.com

ObjectiveTo investigate the role of Apelin in reactive oxygen species (ROS) production in primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and endothelium-dependent vascular dysfunction in diabetic mice.Methods①HUVECs were cultured by medium of high concentration of glucose to induce damage.After pretreatment of Apelin-13 for 1h,the ROS production and Caspase-3 activity(ELISA) were detected respectively.②40 experimental type 1 diabetic mice were randomized equally into control group and diabetic group.Apelin-13 production,endothelium-dependent relaxation and endothelium-independent relaxation in aortic ring were determined respectively.ResultsSignificant decreased Apelin-13 production was observed in HUVECs by high glucose compared with the control group (P=0.01)).Exposure to high glucose increased ROS production and Caspase-3 activity by HUVECs,which were significantly preserved by pretreatment of Apelin-13 (P=0.03，P=0.04).Furthermore,in mouse models of STZ-induced type 1 diabetes,the endothelium-dependent relaxation in aortic ring reduced significantly (P=0.02),which was reversed by pretreatment with Apelin-13.ConclusionsApelin could inhibit vascular endothelial cell ROS generation and apoptosis induced by high glucose,and ameliorate the endothelial dysfunction in diabetic mice.

Diabetes complications；Endothelium,vascular；Oxidative stress；Models,animal

国家自然科学基金(81400354，81300177)；上海交通大学医工交叉项目 (YG2013MS52)；上海市自然科学基金(13ZR1459200)

杨维维，医师，Email：yangweiwei2005136@126.com

方宁远，教授，博士生导师，Email：fangny@sh163.com

R587.2

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.06.028

2017-06-16)