关于NgAgo-gDNA与CRISPR/Cas9技术在基因编辑中脱靶问题及稳定性的分析

熊东彦，李志远，黄丹，慕昕

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）

关于NgAgo-gDNA与CRISPR/Cas9技术在基因编辑中脱靶问题及稳定性的分析

熊东彦，李志远，黄丹，慕昕

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）

自CRISPR/Cas9技术被报道后，2016-05，韩春雨在自然杂志上发表了NgAgo-gDNA技术的成果，他宣称，该技术更优于CRISPR/Cas9。通过比较2种基因编辑技术的原理，针对2种技术在基因编辑过程中的脱靶问题以及稳定性进行分析，论证了NgAgo-gDNA技术能够有效降低基因编辑中的脱靶率，并且gDNA比gRNA更具有稳定性。最后利用自身的知识对NgAgo-gDNA技术无法重复的原因进行分析，找出该技术的关键环节在于获得稳定的5＇磷酸化ssDNA，并阐述了自己对韩春雨被质疑事件的看法。

基因编辑技术；NgAgo-gDNA；CRISPR/Cas9；脱靶

2013-02，SCIENCE报道了张峰等的文章中关于CRISPR/Cas9（后简称“Cas9技术”）基因敲除新技术的内容，随后各国生物学家快速加入到Cas9技术商业化应用的研究中。但是，随着研究的不断深入发现，Cas9技术在进行基因编辑时，对目的基因的靶向特异性不强。不过，总体上来讲，Cas9对于基因的敲除效率相较于之前的RNAi已经显著提升。2016-05-02，Nature报道了韩春雨等发明的DNA指导的基因组编辑系统NgAgo-gDNA（后简称“gDNA技术”），在韩春雨的文章中，他指出gDNA技术是一种优越于Cas9的技术[1]，它不仅能有效地对目的基因进行编辑，还能将Cas9中存在的脱靶效应的出现率降到最低[2]。

1 2种基因编辑技术的原理介绍

1.1 Cas9技术的原理

CRISPR技术源于1987年日本大阪大学在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因的研究，科学家发现了CRISPR/Cas体系[5]，Cas9是这类体系中最具效率的体系。在这一体统中，crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，此二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA[3]。所以该技术是一种由RNA所引导的DNA编辑技术，现在我们用的Cas9技术工具只有Cas9核酸酶gRNA两部分。利用该工具，我们可以非常方便地进行基因的任意编辑改造，比如基因敲除、敲入或定点突变等。

1.2 gDNA技术的原理

gDNA技术源于荷兰学者发现格氏嗜盐杆菌的Ago蛋白可以有效地利用5＇磷酸化的单链DNA作为gDNA，对基因组进行定点切割造成其双链断裂。具体来说，gDNA技术使用了5＇端磷酸化的单链DNA（简称“gDNA”）指导AGO蛋白切割，gDNA通过与目标基因进行特异性结合，引导AGO蛋白结合于该基因上，切割DNA。切割完成后，利用细胞自身的修复机制完成DNA修复，最终达到对目的基因的编辑。所以，gDNA技术是一种由单链DNA引导DNA进行基因编辑的技术。

2 2种技术在脱靶问题中的比较

哈佛大学David在Nature杂志发表了他们实验室利用体外筛选和高通量测序检测Cas9技术的脱靶存在较高脱靶现象。韩春雨在其论文中指出，他的科研组发明的技术能够大大改善基因编辑中的脱靶问题。

Cas9技术成功与否的关键问题在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM位点的8～10 bp不能和非目的区有高同源性[5]。因为gRNA本身的序列较短，通常为19 bp，所以其本身的特异性不高。而实验中，为了降低脱靶效率，经常使用2个gRNA作为向导，共同引导Cas9酶与目标位点结合。然而，加入2个gRNA后，基因编辑的效率又降低。而gDNA技术在gDNA的设计上相对于gRNA具有明显的优势，首先gDNA的长度为24 bp，比gRNA多出5 bp，这样可以大大提升gDNA的特异性识别效率，理论上gDNA技术对基因编辑的精确率可以提高45倍。另外，5＇端磷酸化的gDNA在哺乳动物中本身不存在，这保证了NgAgo不会被内源的DNA序列误导至靶向错误的基因组位点。同时，gDNA一旦与NgAgo结合，就不允许其他DNA片段插进来替换，这又从另一方面保证了不脱靶。所以综上所述，gDNA技术在理论上较Cas9技术在基因编辑中更能够降低脱靶率，提高基因编辑的精确性。

3 2种技术在基因编辑中稳定性的比较

所谓“稳定性”，即指在基因编辑中，导向DNA或RNA、作用蛋白等能否持续有效地维持其活性完成整个编辑过程。Cas9系统中的sgRNA需要由质粒转入细胞并表达，而后形成一定特殊结构才能工作，可控性很差。gDNA系统中的gDNA直接转入细胞，时间和浓度较Cas9系统更可控，但是，NgAgo酶依然要通过表达载体导入，其表达效率等问题依然存在。gDNA理论上不会产生茎环结构。在实际的实验中，gDNA系统在富含GC碱基区域部分的稳定性的确比Cas9高。在实际反应过程中，sgRNA与DNA结合后可能会因为细胞内的其他生物化学过程影响DNA的结构，从而使sgRNA从DNA上脱离。而gDNA在与DNA结合后能够防止其他DNA的插入替换，可以提升编辑过程中的稳定性。

4 对各界质疑韩春雨技术的看法

现在，关于韩春雨等人的gDNA技术无法重复的事件闹得沸沸扬扬。2016-07-30，国际转基因技术协会原主席Lluis向协会会员发信称，NgAgo在哺乳动物细胞的基因编辑中不起作用，建议停止验证韩春雨的实验。从各界的质疑中，我们看出韩春雨的gDNA技术存在某些没有完善的问题。在理论上，gDNA技术相较于Cas9技术的确具有更高的基因编辑效率，但在实际的操作中，gDNA技术因其极难重复而一直被质疑。

在此，笔者认为重复出韩春雨的实验结果的关键点在于获得5＇磷酸化的ssDNA，所以，能够正确合成稳定的5＇磷酸化的ssDNA并成功导入受体细胞并稳定存在是该项实验的难题。在丁香园论坛中看到有人报道，在讨论NgAgo的谷歌讨论小组中，一名无法证实身份的研究者“Jan Winter”表示，他因为替换了一项实验材料，取得了重复实验的成功。结合之前的记者采访，国际转基因技术协会的投票选择，我们还是可以看出韩春雨的实验存在真实性。所以我们应该给予韩春雨及其科研组充分的时间，让他们找出实验中可改善的地方。对待科研，需要秉持怀疑心，也需要有足够的耐心与毅力去探究科研中的种种问题。

5 结论

从理论上分析，gDNA技术因其gDNA的长度比gRNA长，可以大大提高gDNA的特异性识别效率，所以能够较CRISPR/Cas9技术有效降低基因编辑过程中的脱靶率；gDNA技术极难重复的关键原因在于很难获得能够稳定导入细胞并存在的5＇磷酸化ssDNA。

［1］孙瑜，蔡小宁，陈德富，等.NgAgo-gDNA基因组编辑系统的成功及启示［J］.生物信息学，2016（03）：167-172.

［2］杨洁，曹玉锦.新一代基因组编辑技术——NgAgo-gDNA［J］.生物学教学，2016（11）：75.

［3］沈彬.利用CRISPR/Cas9进行基因编辑［D］.南京：南京大学，2014.

［4］吴金青，梅瑰，刘志国.应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率［J］.遗传，2015（01）：55-62.

［5］方锐，畅飞，孙照霖.CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术［J］.生物化学与生物物理进展，2013（08）：691-702.

〔编辑：刘晓芳〕

Q789

：A

10.15913/j.cnki.kjycx.2017.15.005

2095-6835（2017）15-0005-02

熊东彦，就读于东北农业大学生命科学学院，研究方向为生物信息学。