建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条的研制及应用

于子翔, 李 丽, 俞禄珍, 杨翠云, 吴建祥, 黄卫昌, 于 翠*

(1. 上海出入境检验检疫局, 上海 200135; 2. 上海辰山植物园, 上海 201602; 3. 浙江大学生物技术研究所, 杭州 310058)

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条的研制及应用

于子翔1, 李 丽2, 俞禄珍1, 杨翠云1, 吴建祥3, 黄卫昌2, 于 翠1*

(1. 上海出入境检验检疫局, 上海 200135; 2. 上海辰山植物园, 上海 201602; 3. 浙江大学生物技术研究所, 杭州 310058)

为了实现兰花种植苗圃和口岸一线直接检测样品中建兰花叶病毒Cymbidiummosaicvirus(CymMV)和齿兰环斑病毒Odontoglossumringspotvirus(ORSV)的目的,我们研制了上述两种病毒联合免疫胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记单抗C10并固定于胶金垫上;将抗体5B7和4F3分别固定于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗鼠抗体包被固定于硝酸纤维素膜上作为质控线,经优化后组装胶体金试纸条。结果表明研制的联合试纸条特异性强,能够在10 min之内同时检出两种病毒,操作简便。对两个种植苗圃的93份兰花样品进行实际检测所得结果与ELISA的检测结果符合性好(Kappa值分别为84.6%和86.7%),能满足兰花样品中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的初筛要求。

建兰花叶病毒; 齿兰环斑病毒; 联合免疫胶体金试纸条

随着人民生活水平的提高,国人对兰花的品种和数量都有相当大的需求。然而病虫害特别是病毒的侵染会严重影响兰花的品质。目前至少有28种病毒曾被记录可侵染兰科植物,其中各项特性已被清楚掌握,分类地位明确的有建兰花叶病毒Cymbidiummosaicvirus(CymMV)、齿兰环病毒Odontoglossumringspotvirus(ORSV)、黄瓜花叶病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)、烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)、烟草脆裂病毒Tobaccorattlevirus(TRV)、番茄环斑病毒Tomatoringspotvirus(ToRSV)、番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltorthotospovirus(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒Impatiensnecroticspotorthotospovirus(INSV)、建兰环斑病毒Cymbidiumringspotvirus(CymRSV)、菜豆黄花叶病毒Beanyellowmosaicvirus(BYMV)、芜菁花叶病毒Turnipmosaicvirus(TuMV)、三叶草黄脉病毒Cloveryellowveinvirus(CYVV)和兰花斑点病毒Orchidfleckdichorhavirus(OFV)等13种[1-2],而对于兰花上最近发生的辣椒褪绿病毒Capsicum chlorosis virus (CaCV)、石斛脉坏死病毒Dendrobium vein necrosis virus (DVMV)和蝶兰褪绿斑病毒Phalaenopsis chlorotic spot virus(PhCSV)等15种病毒的分类地位、传播方式及侵染过程等尚不十分明确。

针对侵染兰花的病毒检测,酶联免疫吸附(ELISA)和RT-PCR分子检测应用较为普遍[3-6]。这两种方法特异性较强且灵敏度高,但是需要一定的试验场所、仪器设备,不适合口岸一线及苗圃的现场检测。免疫层析胶体金试纸条检测是一种简便、灵敏、适合现场快速检测的方法,目前已有侵染葫芦科的4种病毒的免疫胶体金试纸条研制成功[7],但均无成功应用报告,此外还有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒联合免疫胶体金试纸的研制8]等。在兰花病毒病的发生中以CymMV和ORSV最为普遍,危害也最大,而CymMV和ORSV的复合胶体金免疫层析试纸条的研究尚未见报道,因此研制这两种主要兰花病毒的试纸条可以快速筛查出带病植株,将在我国兰花的进出境口岸一线和兰花种植苗圃中发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 病毒来源

建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒阳性对照购自美国Agdia公司,用于试纸条的灵敏度检测;南芥菜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒阳性对照购自美国Agdia公司,用于验证试纸条检测的特异性;辰山植物园兰花培养温室、孙桥农业园区兰花种植苗圃采集的样品用于验证试纸条检测的准确性。

1.2 胶体金的制备、鉴定

采用常规的氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金。具体制备和鉴定过程参考魏梅生等的方法[8-10]。将烧制的胶体金溶液用紫外-可见光分光光度计(岛津UV-2450)进行全波长扫描鉴定。

1.3 抗体配对筛选

先将所有抗体分别稀释至2 mg/mL,然后分别标记和包被,CymMV采用4×4配对,ORSV采用6×6配对,组装简易试纸条进行抗体配对筛选。

1.4 免疫胶体金试纸条制备工艺优化

着重对标记量、标记pH、复溶液配方、胶体金与抗体配比量进行优化,具体优化过程参照魏梅生等的文献进行[9]。

1.4.1 免疫胶体金制备及条件优化

取10支洁净小试管分别加入1 mL胶体金,用0.2 mol/L K2CO3分别调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,加入不同浓度的待标记单抗50 μL,使其终浓度分别为5、7.5、10、12.5、15 μg/mL,混匀后室温静置反应15 min,加入100 μL 10% NaCl溶液,观察颜色变化。根据结果确定免疫胶体金的最适pH及抗体标记量。标记了胶体金后的单抗加入10%BSA封闭15 min,离心弃上清,用复溶液复溶沉淀至合适的比例,用喷金仪器涂在玻璃纤维纸上,制作胶金垫。

1.4.2 检测线和质控线

用0.02 mol/L PBS(pH 7.4)将CymMV和ORSV单克隆抗体稀释到1.0 mg/mL,划线于硝酸纤维素膜(NC膜)上,作为检测线(test line)。T1线为ORSV的检测线,T2线为CymMV的检测线。用0.02 mol/L PBS(pH 7.4)将羊抗鼠IgG分别稀释到1.0 mg/mL,划线在硝酸纤维素膜上,37℃烘干,作为质控线(control line),简称C线。

1.5 试纸条组装

以硝酸纤维素膜作为固相载体,用1.3筛选出的ORSV特异性单抗制作检测线T1,CymMV特异性单抗制作检测线T2,羊抗鼠二抗制作质控线C,包被在硝酸纤维素膜上(图1)。

图1 联合免疫胶体金试纸条工艺设计图Fig.1 Design of the complex gold immunochromatography assay stripe

用1.4.1筛选出的ORSV/CymMV通用型单抗C10制作成胶金垫。将包被膜和胶金垫配以样品垫、吸水滤纸、PVC底板等制作成大板,然后用切条机切割成一定宽度的试纸条,装卡、装袋、包装。

1.6 试纸条的质量检测

1.6.1 特异性检测

分别将建兰花叶病毒、齿兰环斑病毒、南芥菜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒阳性对照按照说明与2 mL的PBS缓冲液混匀,低速离心5 min,上清即为制备好的待检样品。将上述溶液取60 μL滴于加样孔中进行检测,每种病毒重复2次。

1.6.2 灵敏度检测

取CymMV和ORSV阳性对照进行倍比稀释获得10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍和1 280倍的样品稀释液,分别用试纸条进行灵敏度检测,测试方法同1.6.1。

1.7 兰花样品检测

分别在辰山植物园兰花培养温室、孙桥农业园区兰花种植苗圃采集有症状样品,利用免疫胶体金试纸条及DAS-ELISA方法分别进行检测,将结果进行对比分析,若结果不一致,再利用RT-PCR方法进行验证。

1.8 Kappa值计算

Kappa值用于评价两种不同方法的检测结果是否具有一致性,是描述检测一致性较为理想的指标。本文采用不带加权的计算方法评价DAS-ELISA和免疫胶体金试纸条的一致性。Kappa=(Po-Pc)/(1-Pc),其中Po为实际一致率,Pc为理论一致率。Po=(a+d)/n;Pc=[(a+b)(a+c)+(c+d)(b+d)]/n2。

表1Kappa值计算表格

Table1TableforcalculatingthevalueofKappa

方法1Method1方法2 Method2阳性数量/份Positivesamplenumbers阴性数量/份Negativesamplenumbers合计Total阳性数量Positivesamplenumbersabg1阴性数量Negativesamplenumberscdg2合计Totalf1f2n

2 结果与分析

2.1 抗体配对筛选

抗体经过纯化后分别通过4×4和6×6的交叉配对反应,确定CymMV的C10与5B7、ORSV的4F3和6B4配对最佳。将上述4株单抗分别组合,制作二合一试纸条。利用该试纸条分别检测CymMV和ORSV,结果发现两个病毒之间存在严重的交叉反应,结果无法判定。进一步研究分析,单抗C10与ORSV存在明显的交叉反应,因此可利用此特性,将C10作为通用型抗体用来制作胶体金,然后再用CymMV和ORSV特异性单抗分别制作检测线。经进一步筛选,确定最佳配对方式为：胶体金标记C10—分别包被4F3和5B7作为T1和T2检测线。

2.2 免疫胶体金试纸条优化参数

经过试验,免疫胶体金试纸条的条件优化如下：胶体金制备按照V氯金酸(1%)∶V柠檬酸三钠(1%)=1∶1的比例烧制,粒径约40 nm;单抗C10标记量为10 μg/mL,标记pH为8.0;金标记物复溶液配方为: 0.1 mol/L Tris+10%蔗糖+1%PVP+1%BSA+0.5% Tween-20,盐酸调pH至8.5;胶体金复合物浓缩比例为100 μL/mL;胶体金复合物喷涂量为10 μL/cm;检测线T1,单抗4F3浓度为1.5 mg/mL;检测线T2,单抗5B7浓度为1.5 mg/mL;质控线,羊抗鼠IgG浓度为1.5 mg/mL;检测线T1、T2和质控线划膜量均为1 μL/cm。

2.3 试纸条特异性

分别使用滴管滴加建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒阳性对照约60～100 μL后,相应病毒的检测线及质控线出现明显条带;两种病毒阳性对照混合后各取50 μL加入检测孔后,两条检测线和质控线均出现明显条带;加入南芥菜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、番茄花叶病毒的阳性对照,仅质控线出现条带,因此本试纸条具有较好的特异性。

2.4 试纸条灵敏度

分别将稀释10、20、40、80、160、320、640、1 280倍的CymMV和ORSV阳性对照滴加于样品孔检测试纸条的灵敏度。结果发现试纸条可检测稀释至40倍的齿兰环斑病毒汁液,而建兰花叶病毒汁液稀释至160倍仍可以检测到。

2.5 DAS-ELISA检测与免疫胶体金试纸条的检测比对结果

从辰山植物园采集带有症状的兰花样品7份,分别进行免疫胶体金试纸条检测和DAS-ELISA检测,结果(表2)表明,除7#样品外,DAS-ELISA检测与免疫胶体金检测结果基本一致,反应程度也基本一致。7#样品ORSV试纸条检测为阴性,而DAS-ELISA检测为阳性,对该样品进行RT-PCR检测,结果为阳性,这一结果表明免疫胶体金试纸条对ORSV的检测灵敏度较低，有可能出现假阴性结果。

表2兰花样品DAS-ELISA和免疫胶体金试纸条检测结果比较1)

Table2DetectionresultofDAS-ELISAandcomplexgold-immunochromatographyassaystripes

检测方法Methods阳性对照PositivecontrolORSVCymMV样品Sample1#ORSVCymMV2#ORSVCymMV3#ORSVCymMV4#ORSVCymMV5#ORSVCymMV6#ORSVCymMV7#ORSVCymMV健康对照HealthycontrolORSVCymMV试纸条Assaystripe+++++++++++±++++++++++-++++±+-++++±+--DAS⁃ELISA(OD)1．0600．4351．3703．5500．2703．3410．9853．6120．1743．1950．2190．3420．1463．2091．0000．3730．120．129

1) “+”表示试纸条检测线颜色的深浅,+越多,表明病毒含量越高; “±”表示试纸条检测线颜色肉眼不易判定;“-”表示未检出。OD值为酶标仪在405 nm波长下测得的数值。

“+” means the depth of the color of the test line, more “+”, more virus; “±” means the test line cannot be determined with eyes; “-” means the result was not detected. OD value is the absorption values under wave 405 nm with microplate reader.

2.6 兰花样品检测

我们从辰山植物园、孙桥农业园区采集93份样品进行检测对比,免疫胶体金试纸条检出CymMV阳性样品51份,ORSV阳性样品38份,其中CymMV和ORSV同时侵染样品28份,而DAS-ELISA检测出CymMV阳性样品58份,ORSV阳性样品43份,CymMV和ORSV同时侵染样品31份。利用Kappa值来比较两种检测方法的符合性,由表3、表4可知免疫胶体金试纸条与DAS-ELISA检测CymMV和ORSV的符合率均超过80%,基本能够满足田间及口岸一线的检测需求。

表3免疫胶体金试纸条与DAS-ELISA检测CymMV的一致性评价(Kappa值)

Table3ResultconsistencybetweenDAS-ELISAandcomplexgoldimmunochromatographyassaystripesbasedonKappavaluefordetectionofCymMV

免疫胶体金试纸条Complexgoldimmunochromatographyassaystripes双抗体夹心酶联免疫吸附法 DAS⁃ELISA阳性数量/份Positivesamplenumbers阴性数量/份Negativesamplenumbers合计Total阳性数量Positivesamplenumbers51051阴性数量Negativesamplenumbers73542合计Total583593Kappa值=84．6%

表4免疫胶体金试纸条与DAS-ELISA检测ORSV的一致性评价(Kappa值)

Table4ResultconsistencybetweenDAS-ELISAandcomplexgoldimmunochromatographyassaystripesbasedonKappavaluefordetectionofORSV

免疫胶体金试纸条Complexgoldimmunochromatographyassaystripes双抗体夹心酶联免疫吸附 DAS⁃ELISA阳性数量/份Positivesamplenumbers阴性数量/份Negativesamplenumbers合计Total阳性数量Positivesamplenumbers38038阴性数量Negativesamplenumbers64955合计Total444993Kappa值=86．7%

3 讨论

本研究在获得建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒单克隆抗体的基础上研制了建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条。该试纸条能够在10 min之内检出这两种严重危害兰花的病毒,且特异性强,效果稳定,操作简便,与DAS-ELISA的检测结果符合性好(Kappa值分别为84.6%和86.7%),能够满足兰花实际样品中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的检测,实现种植苗圃及口岸现场一线使用的目标。

免疫胶体金试纸条在现场使用过程中虽然操作比较简单,但是还需注意以下两点:①由于病毒分布的不均一性,不同位置取样会导致结果出现差异性,特别是不同样本之间相对强度的偏差,在生产调试过程中,检测7#样本时,ORSV未检出明显反应,而DAS-ELISA阳性,出现这一结果原因可能是两种方法使用抗体不同,对病毒的检测灵敏度不同,而导致结果有差异;②样本处理之后,放置时间较长,结果会出现明显的波动性,建议样本处理后及时检测,不要放置过夜。

[1] Zettler F W, Ko N J, Wisler G C, et al. Viruses of orchids and their control [J]. Plant Disease, 1990, 74: 621-625.

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(责任编辑： 杨明丽)

ComplexgoldimmunochromatographyassayandapplicationforrapiddetectionofCymbidiummosaicvirusandOdontoglossumringspotvirus

Yu Zixiang1, Li Li2, Yu Luzhen1, Yang Cuiyun1, Wu Jianxiang3, Huang Weichang2, Yu Cui1

(1.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200135,China; 2.ShanghaiChenshanBotanicalGarden,Shanghai201602,China; 3.InstituteofBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

In order to directly detectCymbidiummosaicvirus(CymMV) andOdontoglossumringspotvirus(ORSV) in planting garden and import port, we developed gold-immunochromatographic assay stripe kit. Tri-sodium citrate with aqueous gold chloride was warmed up and mixed to make colloidal gold particles. Monoclonal antibody (McAb) C10 was selected to conjugate with colloidal gold as the detector antibody that was spotted on a conjugated pad, and the McAb 5B7 and 4F3 were used as capture antibody at the test line (T) respectively. Goat anti-mouse IgG antibody was used capture antibody at the control line (C). After an optimized process, the assay stripes were packaged. The result indicated that the viruses could be specifically detected on immune-strip within 10 minutes. 93 samples from Chenshan Botanical Garden and Sunqiao Agricultural Garden were tested, and the results were compared with those obtained by DAS-ELISA in order to examine the reliability. The two methods showed significant consistence (Kappa=84.6% and 86.7 % of CymMV and ORSV, respectively). The established gold-immunochromatographic assay could meet the requirements of primary screening of the two viruses in the gardens and the ports.

Cymbidiummosaicvirus;Odontoglossumringspotvirus; complex gold immunochromatography assay

2017-03-28

2017-05-16

上海市绿化和市容管理局(G152427)

* 通信作者 E-mail: yuc@shciq.gov.cn

S 41-30

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.023