HPLC法测定杨梅中两种黄酮的含量研究
2017-11-29李雅丽顾田甜马旗联郝丽莉刘江云
吴 飞 李雅丽 顾田甜 马旗联 郝丽莉 刘江云,*
1.苏州大学医学部药学院,江苏 苏州 215123;2.新疆医科大学第一附属医院,新疆 乌鲁木齐 830011
HPLC法测定杨梅中两种黄酮的含量研究
吴 飞1李雅丽2顾田甜1马旗联1郝丽莉1刘江云1,2*
1.苏州大学医学部药学院,江苏 苏州 215123;2.新疆医科大学第一附属医院,新疆 乌鲁木齐 830011
目的:建立杨梅中二种主要黄酮类成分的同时含量测定方法。方法:采用Cosmosil -5C18-PAQ 色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-0.1% 乙酸溶液梯度洗脱;流速1.0mL/min;二极管阵列检测器,检测波长520nm(1)和360nm(2),同时测定杨梅中矢车菊素-3-葡萄糖苷(1)、杨梅苷(2)的含量。结果:二种黄酮类成分色谱分离良好,线性范围依次为20.08~200.8g/mL(r=0.9996,1)、3.984~39.84 g/mL(r=0.9995,2),加样回收率依次为97.5%、96.2%。结论:该测定方法快速准确,可为杨梅的质量分析方法提供参考。
杨梅;HPLC;矢车菊素-3-葡萄糖苷;杨梅苷
杨梅(MyricarubraSieb.et Zucc.)是我国的特产水果之一,主要种植在长江流域以南的浙江、江苏、云南、广西等地区。杨梅具有消食、除湿、解暑、生津止咳、助消化、御寒、止泻、利尿、防治霍乱等多种功效,有“果中玛瑙”之誉[1]。《本草纲目》记载杨梅有“止渴、和五脏、涤肠胃等功能”。研究表明,杨梅中含有花色素、杨梅素等黄酮类物质,以及丰富的有机酸、糖类、维生素、蛋白质等活性成分,具有抗氧化、抗炎、抗菌、增强机体免疫力、降血糖、降血脂等多种药理作用[1]。杨梅中的红色素(杨梅红)是一种花色苷类天然色素,其中主要成分为矢车菊素-3-葡萄糖苷(1),已于2015年获批为食用添加剂[2]。市售品杨梅提取物可从树皮、叶、果中提取,杨梅苷(2)是其中主要有效成分之一。
杨梅果实成熟期集中在高温多雨的6、7月份梅雨季节,不耐贮运,有“一日味变,二日色变,三日质变”的说法,采摘、运输过程中稍稍挤压和碰撞极易变质,常温货架期仅2~3天,这极大限制了新鲜杨梅的产销和深加工[3]。本文对杨梅鲜果中两种主要成分1和2的含量同时测定方法进行研究,为杨梅的质量分析和深入开发应用提供科学参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱系统(包括1260 Infinity VL 型四元泵,1260 DAD VL 检测器,LC-Solution色谱工作站,美国Agilent 公司);ODS色谱柱(5C18- PAQ,4.6mm×250mm,日本Cosmosil公司);MP2002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);ME215S型电子天平(德国Starorious公司);SB-5200DTDN超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2 材料 杨梅果实(MR161001;冻存)购自常熟虞山宝岩,经苏州大学药学院陆叶博士鉴定为杨梅科植物杨梅(Myricarubra)的果实。矢车菊素-3-葡萄糖苷对照品为本实验室自制(按液相相对峰面积计,HPLC纯度为93.2%);杨梅苷对照品(HPLC纯度大于98%,南京森贝伽生物科技有限公司)。乙腈(色谱纯,瑞士Oceanpak公司);纯净水(杭州娃哈哈公司);冰乙酸、乙醇、甲醇等其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取矢车菊素-3-葡萄糖苷对照品10.04mg置10mL棕色容量瓶中,加50%甲醇超声溶解,定容,作为对照品1储备液(1.004mg/mL);分别精密量取对照品1储备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL于10mL棕色容量瓶中,用50%甲醇定容,制成系列矢车菊素-3-葡萄糖苷对照品溶液。
另精密称取杨梅苷对照品9.96mg 置10mL棕色容量瓶中,同法制成对照品2储备液(0.996mg/mL);分别精密量取对照品2储备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL于50mL容量瓶中,用50%甲醇定容,制成系列杨梅苷对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备 取供试品10枚,解冻至常温,去核,称重为55.04g。杨梅果肉样品捣碎,超声破碎,取约5.0g,精密称定,置50mL棕色容量瓶中,加50%甲醇适量,超声(功率250W,频率40kHz)提取30min,室温下定容,经0.45μm滤膜滤过,即得。
2.3 色谱条件 色谱柱:Cosmosil-5C18-PAQ色谱柱(4.6mm×250mm);以0.1%乙酸溶液(A)- 乙腈(B)为流动相梯度洗脱(0~30min,5%B ~ 53%B);流速1.0mL/min;柱温40℃;检测波长:360、520nm。进样量20μL。在该色谱条件下,绘制对照品及供试品色谱图,如图1所示。图中对照品及供试品中的各色谱峰分离良好,分离度均大于1.5。
2.4 线性关系考察 分别取对照品1、2系列溶液,按“2.3”项下色谱条件进行测定。以对照品浓度为横坐标,以峰面积值为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。得到矢车菊素-3-葡萄糖苷的线性方程为Y=3.8747X-34.419,R2=0.9996,线性范围20.08-200.8μg/mL;杨梅苷的线性方程为Y=19.513X-2.3965,R=0.9995,线性范围3.984~39.84μg/mL。结果表明各成分在各自浓度范围内线性关系良好。
2.5 精密度考察 精密吸取供试品溶液20μL,重复进样6次,以峰面积指标计算RSD(n=6),考察方法的精密度。结果测得成分1和2的RSD分别为1.94%和0.77%,表明仪器的精密度符合分析要求。
2.6 重复性考察 按“2.2”项下方法平行制备6份样品供试品溶液,按“2.3”项色谱条件测定2种成分的含量。以含量为指标计算RSD,考察方法的重复性。结果测得成分1和2按鲜品计的含量依次为580.9、56.53mg/g,RSD依次为1.61%、1.88%,表明本法重复性符合分析要求。
2.7 稳定性考察 取供试品溶液分别于0、4、8、12、16和24 h进样分析,测定2种成分峰面积,以峰面积值为指标计算RSD(n=6)。结果测得成分1和2的RSD依次为2.15%、1.92%,表明本法供试品24h内稳定性良好。
2.8 加样回收实验 精密称取已知含量的杨梅果肉样品2.5g,共称取6份,分别加入精密对照品混合溶液(其中含对照品1和2依次为1.535、0.1594 mg/mL)1mL,按照“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备。成分1和2的平均回收率分别为97.5%、96.2%,详见表1。
表1 加样回收率实验结果 (n=6)
2.9 样品测定 按“2.2”项下制备供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进行测定,计算供试品溶液中2个成分的含量,按鲜品计为586.2、56.97 mg/g。照《中国药典》2015年版水分测定法第二法,检测供试品中水分含量为86.22%。结果:杨梅果肉中矢车菊素-3-葡萄糖苷和杨梅苷的含量按干燥品计,依次为4.254mg/g、0.4134mg/g。
3 讨论
杨梅果实中富含花色苷、有机酸、糖类、维生素、蛋白质等多种营养物质,相关成分分析报道较多[1],但对其中的杨梅苷等黄酮的含量分析报道较少。本文根据花色苷(520nm)、黄酮苷(360nm)两类成分结构导致的紫外-可见光谱特征吸收波长差异,参考相关研究[4-5],采用双波长法同时定量分析花色苷和杨梅苷含量,研究结果表明,该法灵敏度高、简便快捷,可为杨梅的质量分析方法提供参考。此外,在供试品的制备过程中发现,杨梅及其中的花色苷、杨梅苷化学性质不太稳定,在室温25℃以下不宜久置超过24h。
[1]黄海智. 杨梅酚类化合物抗氧化和抗癌功能及机理研究[D].杭州:浙江大学,2015.
[2]本社.GB 2760—2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准[M].北京:中国质检出版社,2011.
[3]杨琴. 杨梅果实劣变机制及保鲜研究[D].杭州:浙江师范大学,2014.
[4]Shaohuan Zhou, Zhongxiang Fang, Yuan Lv, et al. Phenolics and antioxidant properties of bayberry (Myrica rubra Sieb. et Zucc.) pomace [J]. Food Chemistry, 2009(112): 394-399.
[5]齐洁,万竹青,李默影,等. HPLC法测定杨梅叶中杨梅苷的含量[J].中国野生植物资源, 2012 (1): 35-37.
Determination of Two Flavonoids in Myrico rubra by HPLC
WU Fei1LI Yali2GU Tiantian1MA Qilian1HAO Lili1LIU Jiangyun1,2*
1.College of Pharmaceutical Sciences, Suzhou University, Suzhou 215123, China;2.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of two flavonoids in the fruits ofMyricorubra. Methods The chromatographic separation was performed on a Cosmosil - 5C18-PAQ column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a gradient elution of acetonitrile and 0.1% acetic acid solution, at a flow rate of 1.0 mL/min, and detected at both 520 nm (for cyanidin-3-glucoside, 1) and 360 nm (for myricetrin 2) using diode array detector. Results The two compounds were separated with satisfaction, with linearity ranges between 20.08~200.8 g/mL (r=0.9996, 1) and 3.984~39.84 g/mL (r=0.9995, 2), and average recovery rates to be 97.5% and 96.2%. Conclusion The method is accurate and selective, which could be applied for the quality analysis ofMyricorubra.
Myricorubra; HPLC; Cyanidin-3-glucoside;Myricetrin
R285
A
1007-8517(2017)20-0024-03
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2015211C053)。
吴飞(1986-),男,汉族,硕士研究生在读,研究方向为天然产物研究与开发。E-mail: wufeit@sina.com
刘江云(1972-),男,汉族,博士研究生,副教授,研究方向为天然产物研究与开发研究。E-mail: liujiangyun@suda.edu.cn
2017-08-24 编辑:穆丽华)