镉胁迫对铜绿微囊藻的抑制作用及营养盐浓度对其的减缓效应

倪利晓，陈春明，马艳艳

(1.河海大学环境学院，江苏 南京 210098；2.江苏科易达环保科技有限公司，江苏 盐城 224000)

镉胁迫对铜绿微囊藻的抑制作用及营养盐浓度对其的减缓效应

倪利晓1，陈春明1，马艳艳2

(1.河海大学环境学院，江苏 南京 210098；2.江苏科易达环保科技有限公司，江苏 盐城 224000)

为研究镉胁迫对铜绿微囊藻的生长和生理特征影响，评估氮、磷在减缓镉胁迫中作用，将处于指数生长期的铜绿微囊藻接种于不同的镉胁迫浓度和3种营养盐水平下96 h。结果表明，当镉浓度小于10 μmol/L，随着氮、磷浓度增大，藻的生物量、比生长速率、叶绿素a、可溶性蛋白、可溶性糖的浓度和超氧化物歧化酶活性随之增加，然而在镉浓度为10 μmol/L时铜绿微囊藻的这些指标含量基本相同，但类胡萝卜素只有在镉浓度为10 μmol/L时才会出现明显的降低。

氮；磷；镉；生理特征；铜绿微囊藻；镉胁迫

随着人类生产生活、工业等的快速发展，生活污水、工业废水和农业废水造成的水体富营养化日益严重，成为我国大多水体普遍面临的环境问题[1]，其中，N和P是最主要的营养盐，往往导致藻类疯长，形成水华、赤潮等。太湖是我国富营养化最严重的湖泊之一,蓝藻水华频繁发生。铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)是蓝藻水华的主要藻种。影响铜绿微囊藻生长的因素有很多，例如温度、光照、营养盐、有机物等环境因素[2]。

重金属具有毒性大、难降解、易累积等性质，对水生生态系统的健康构成严重威胁，沉积物重金属污染已经引起广泛关注，镉(Cd)是环境中对植物、动物以及人类毒性最强的过度金属元素之一[3]。营养盐与重金属共存时，会对水华蓝藻的生长及生理产生影响。关于N、P与重金属对铜绿微囊藻生物量影响的研究较多[4]，但对其生理作用机制研究较少。本文以水华蓝藻铜绿微囊藻为实验藻种，研究N、P营养盐浓度改变情况下，Cd对铜绿微囊藻的生长及生化指标的影响，以期为进一步研究铜绿微囊藻吸附Cd的生理生化机制奠定理论基础。

1 实验材料与方法

1.1 藻的培养

铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa, FACHB3-905)购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。实验前，使用BG-11培养基[5]预培养7～10 d，使之处于对数生长期。培养条件：光照强度为40～60 μmol/(m2·s)，光暗比为14/10，温度为25℃，静置培养，每天摇动若干次。实验前部分藻种饥饿培养3 d，后将藻种以5 000 r/min离心后用质量浓度为15 mg/L的NaHCO3溶液洗涤2次，去掉上清液后接种至含不同浓度N、P的培养基中驯化扩大培养14 d。

1.2 实验设计

以BG-11培养基为基础，其他营养元素浓度不变，只改变N、P浓度，并设置高、中、低3个营养盐水平，用NaNO3和K2HPO4·3H2O调控N、P质量浓度，依次分别为123.5 mg/L、3.56 mg/L；12.35 mg/L、0.356 mg/L；1.235 mg/L、0.035 6 mg/L。实验用250 mL 的锥形瓶，均放入150 mL不同营养盐浓度的培养液，将准备好的处于对数生长期的铜绿微囊藻接种于不同N、P浓度培养基中，并控制初始藻相对质量密度为0.2，并用CdCl2·2.5H2O设置Cd浓度分别为：0、1、2、4、10 μmol/L，每组设3个平行，每天定时人工摇动3次，每隔24 h于680 nm波长处测吸光度(O680)，并在96 h时测各生理指标。

1.3 生理指标测定

1.3.1 比生长速率的测定

为了评估铜绿微囊藻的生长，按照式(1)计算每个实验组的比生长速率[6]：

μ=ln(Xn/Xn-1)/(tn-tn-1)

(1)

式中：μ为比生长速率，1/d；Xn为tn时刻藻细胞密度，个/mL。

1.3.2 光合色素的测定

叶绿素(Chl-a)是藻类进行光合作用的色素，植物、藻类等生物在遭受环境胁迫时,反映其光合强度的Chl-a、胡萝卜素等色素会发生变化。Chl-a的测定参照Eullaffroy等[7]的方法并加以改进，即取50 mL藻液，4 000 r/min离心10 min，弃上清液，使用蒸馏水洗涤2次后，用95%乙醇定容至5 mL，避光，置于4℃下提取24 h。取上清液放入1 cm 比色杯，以95%乙醇为空白，用分光光度计测定波长470 nm、665 nm和750 nm时的吸光度。根据ρ(Chl-a)和类胡萝卜素在95%乙醇吸光系数而建立的公式来计算Chl-a和类胡萝卜素的质量浓度ρ(X·C)[8]：

ρ(Chl-a)=11.93(O665-O750)

(2)

ρ(X·C)=[1 000O470-ρ(Chl-a)]/245

(3)

式中：O665、O750、O470分别为波长为665、750、470 nm时的吸光度。

1.3.3 可溶性蛋白和可溶性糖的测定

可溶性蛋白含量的测定参照Bradford[9]的方法。取一定量(30～50 mL)的藻液，4 000 r/min离心10 min，弃上清液，使用蒸馏水洗涤2次后，超声波破碎10 min，11 000 r/min下离心15 min，上清液即为提取液，用于测可溶性蛋白和可溶性糖。用牛血清蛋白质溶液做标准曲线，准确取1 mL蛋白提取液于试管中，再加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合后放置2 min，以加入蒸馏水的考马斯亮蓝G-250的溶液为对照，在595 nm波长下比色，在标准下计算蛋白质浓度。

可溶性糖采用苯酚法测定[10]。用蔗糖溶液做标准曲线，吸取2 mL可溶糖提取液于试管中，按顺序分别加入5%苯酚溶液0.5 mL，浓H2SO45 mL，然后摇匀，并室温放置30 min，显色，在485 nm波长处测定吸光度，可溶性糖含量由标准曲线查出。

1.3.4 超氧化物歧化酶的测定

超氧化物歧化酶活性(super oxide dismutase，SOD)测定参照Beauchamp的方法[11]。取一定量(30～50 mL)的藻液，4 000 r/min离心10 min，弃上清液，使用pH=7.8的50 mmol磷酸缓冲溶液洗涤2次后，超声波破碎10 min，在4℃、11 000 r/min下离心15 min，上清液即为酶提取液。取1 mL粗酶液，依次加入0.8 mL磷酸缓冲溶液(50 mmol/L,pH=7.8)，0.3 mL甲硫氨酸溶液(130 mmol/L)，0.3 mL Na2EDTA溶液(100 μmol/L)，0.3 mL核黄素溶液(20 μmol/L)，0.3 mL 氮蓝四唑溶液NBT(750 μmol/L)和1 mL酶提取液，总计3 mL，置于40～60 μmol/(m2·s)光照强度、25℃温度下反应30 min。反应结束后移至黑暗环境终止反应。用未加核黄素的酶反应体系液作空白，未加酶液的反应体系做对照，在560 nm波长下分别测定各管的吸光度。根据在光照条件下SOD抑制NBT的还原作用来确定酶活性的大小，将NBT的还原抑制到对照组还原进程的50%时所需的酶量为1个酶活性，根据式(4)计算SOD的酶活性Asod。

(4)

式中：s为样品照光后的吸光度；a为未加酶反应液照光后吸光度；b为未加酶反应液照光前吸光度；n为酶液稀释倍数。

1.3.5 数据处理

用origin 9.2软件绘图，实验数据采用SPSS13.0软件处理。对照组和实验组之间采用单因素方差分析，Plt;0.05表示有显著性差异；Plt;0.01表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 Cd对铜绿微囊藻生长的影响

相关研究表明O680和藻细胞数量有很好的相关性[12]，不同营养盐水平下Cd对铜绿微囊藻生长和比生长速率的影响见图1。由图1(a)～(c)可以看出，Cd对藻的生长抑制作用随着Cd浓度的增加逐渐增强。在低营养盐水平下，1、2 μmol/L Cd实验组藻数量与对照组相比变化不大，4、10 μmol/L Cd实验组藻细胞数量明显降低(plt;0.05)。在中、高营养盐水平下，1 μmol/L Cd与藻作用96 h后，藻细胞数量略高于对照组，说明1 μmol/L Cd对藻的生长起着低促高抑的效果，即Hormesis效应[13]；2 μmol/L Cd对藻有明显的抑制作用，低、中、高营养盐水平下藻细胞数量分别是对照组藻细胞数量的91.04%、66.92%、77.35%；4、10 μmol/L Cd实验组藻细胞数目均低于同时期对照组(plt;0.01)，4 μmol/L Cd与藻胁迫时，低、中、高营养盐水平下藻细胞数量分别是对照组藻细胞数量的48.44%、46.87%、54.93%，说明4 μmol/L Cd对铜绿微囊藻的生长有较强的抑制作用；10 μmol/L Cd胁迫使藻处于明显抑制状态，且营养盐浓度的提高也不能使抑制作用减弱，毒性减少，说明此时的Cd浓度已经超过了藻的最大耐镉含量。图1(d)表明藻的比生长速率随着Cd浓度的增大逐渐降低，随N、P浓度的增大逐渐升高。由图1可说明Cd能抑制铜绿微囊藻的生长，且浓度越大抑制作用越强，而营养盐含量的增大有助于减缓Cd对藻的抑制作用，当Cd浓度超过藻类最大耐镉量时，Cd的毒性致使藻类大量死亡，N、P浓度的提高对此也毫无影响。

2.2 Cd对光合色素含量影响

Chl-a和类胡萝卜素都是藻类进行光合作用的色素，其含量的变化在一定程度上可以反映胁迫作用对藻类光合作用的影响。由图2(a)可以看出，在低营养盐水平下，1 μmol/L Cd的加入使Chl-a的含量略高于对照组，且随着Cd浓度的增大，Chl-a含

(a) 低营养盐

(b) 中营养盐

(c) 高营养盐

(d) 比生长速率

量逐渐降低；而中、高营养盐水平下Chl-a含量随着Cd浓度的增大变化趋势一致，均呈负增长趋势，且Cd浓度越大负增长趋势越大。当10 μmol/L Cd与藻胁迫时，低、中、高3个营养盐水平下Chl-a含量仅为对照组的63.5%、66.6%、66.6%，说明此时铜绿微囊藻Chl-a的含量不受营养盐的影响。由图2(b)可见，Chl-a和类胡萝卜素含量变化趋势和藻细胞数量类似，类胡萝卜素只有在加入10 μmol/L Cd才有明显的变化，说明Chl-a比类胡萝卜素更加敏感地反映光合作用强度。Chl-a含量减少是由于Chl-a合成或者相关酶的合成受到抑制[14]。这表明，Cd可以减弱藻类光合作用，而N、P浓度的提高可以减弱Cd对光合作用的抑制作用，N是藻类进行光合作用的主要元素，充足的N、P浓度下，藻类能够吸收足够的营养物质进行光合作用，N、P浓度过低，藻细胞生理活性降低，则光合作用效率降低，从而光合色素含量下降。但当Cd累积到一定程度，即超过藻的最大耐镉量时，N、P浓度不能影响Cd对藻的毒性，进而不能提高光合作用强度。张皓[15]的研究表明在N、P浓度过高或过低水平下，江蓠在Cd作用下Chl-a含量都不高，在适中的N、P浓度下，江蓠的Chl-a含量则明显升高，与本实验结果一致。

(a) Cd对Chl-a的影响

(b) Cd对类胡萝卜素的影响

2.3 Cd对可溶性蛋白和可溶性糖的影响

不同营养盐水平下Cd对铜绿微囊藻可溶性蛋白和可溶性糖的影响见图3，其变化趋势和藻的比生长速率(图1(d))一致。由图3(a)可见，当Cd浓度为0～2 μmol/L时，可溶性蛋白含量变化不明显，即低浓度Cd对蛋白质影响较小；当Cd浓度为4 μmol/L时，可溶性蛋白含量明显下降，低、中、高营养盐下分别降到对照组的40.32%、41.33%、58.94%，可见在镉胁迫不大时，营养盐浓度的提高有助于减缓Cd对蛋白质合成的抑制作用；当Cd浓度增加到10 μmol/L时，可溶性蛋白含量降到最低，分别仅为对照组的10.40%、11.41%、10.65%，由此说明低浓度Cd对蛋白质影响不明显，高浓度Cd则明显抑制了蛋白质的合成。

(a) Cd对可溶性质蛋白的影响

(b) Cd对可溶性糖的影响

由图3(b)可见，当Cd浓度为4 μmol/L时，可溶性糖含量明显下降，低、中、高营养盐下分别比对照组下降了46.23%、39.92%、31.96%；当Cd浓度增加到10 μmol/L时，可溶性糖含量降到最低，分别仅为对照组的26.82%、25.54%、32.93%，说明低浓度Cd对可溶性糖影响较小，高浓度Cd则明显抑制了可溶性糖的合成，与对可溶性蛋白的影响相似。

可溶性糖在植物体内是最基本和最常见的营养物质，在一定程度上可反映细胞体内生理代谢状况，并能反映光合作用和呼吸代谢的平衡状况[16]。重金属胁迫下藻细胞受到严重损伤，降低了藻细胞的正常生理代谢，从而使可溶性糖含量降低。Cd胁迫下绿色巴夫藻可溶性糖含量与对照组相比明显降低，Cd为20 mg/L时仅为对照组的35%，是由于绿色巴夫藻体内的细胞器受到损伤，从而生理各指标含量降低[17]。

2.4 Cd对超氧化物歧化酶的影响

植物体内存在负责清扫活性氧的抗氧化系统，当机体受到胁迫后，体内会产生过量的自由基(主要为H2O2、·OH、O2-)，从而影响细胞的正常生理代谢并损害膜结构，此时浮游植物便会启动自身的防御系统，体内的抗氧化酶(如SOD、POD、CAT等)和非酶类抗氧化剂(如AsA、GSH等)能够清除体内过多的活性氧自由基来抵抗氧化损伤，维持生物体内正常生理代谢，保护藻细胞免受氧化伤害。其中超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内重要的抗氧化酶之一，是需氧生物细胞内抗氧化防御系统中的第一道防线[18]。由图4可见，在3种营养盐水平下，SOD活性均随Cd浓度增加呈先上升后下降趋势，当Cd浓度为4 μmol/L时，SOD活性达到最大值，说明受Cd的胁迫，SOD酶活性被诱导，以提高对超氧阴离子自由基的清除能力，从而减少对细胞的氧化损伤。在相同Cd浓度下，随着营养盐浓度的升高，藻SOD活性相对降低。而当Cd浓度为10 μmol/L时，SOD活性则明显下降，且3个营养盐水平下基本相同，说明过高浓度Cd的胁迫超过了藻的耐受能力，已经超出了藻细胞通过提高SOD活性来抵制抗氧化能力的范围，这与郐安琪等[19]的研究结果相一致。

图4 不同营养盐水平下Cd对铜绿微囊藻SOD活性影响(plt;0.05)

3 结 论

a. 营养盐浓度的增加有利于提高铜绿微囊藻的生理活性及抗Cd能力。低Cd浓度(lt;10 μmol/L)下随着N、P营养盐浓度的增加，铜绿微囊藻生物量、叶绿素a、类胡萝卜素、可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD活性均随之增加，在高Cd浓度(10 μmol/L)下，铜绿微囊藻各生理生化指标含量基本相同。

b. 低、中、高3种营养盐水平下，随着Cd浓度的增加，铜绿微囊藻生物量、叶绿素a、可溶性糖、可溶性蛋白含量逐渐下降，比生长速率降低，SOD活性则呈先上升后下降趋势，类胡萝卜素对Cd耐受性较强，仅在10 μmol/L Cd时明显下降。

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InhibitoryeffectsofcadmiumstressonMicrocystisaeruginosaandthealleviationeffectsofnutrientconcentrations

NILixiao1，CHENChunming1，MAYanyan2

(1.CollegeofEnvironmental,HohaiUniversity,Nanjing210098,China； 2.JiangsuKeyidaEnvironmentalProtectionTechnologyCo.,Ltd,Yancheng224000,China)

The aim of this study was to investigate the effects of cadmium(Cd) stress on growth and physiological traits in cyanobacteriaMicrocystisaeruginosa(M.aeruginosa) and to evaluate the role of nitrogen (N) and phosphorus (P) in cadmium stress alleviation. Microcystis aeruginosa in exponential growth stage was inoculated with different Cd stress concentrations and 3 kinds of nutritive salt for 96h. When cadmium concentration was less than 10 μmol/L, with the increase of the concentration of nitrogen and phosphorus, cadmium stress caused an enhancement in biomass, specific growth rate, chlorop hyll-a (Chl-a), soluble protein, soluble sugar and super oxide dismutase (SOD) activity, and basically the same concentration occurred to the above indexes at 10 μmol/L Cd. The carotenoids had obvious decline just whenM.aeruginosawere exposed to 10 μmol/L Cd.

nitrogen；phosphorus；cadmium；physiological traits；microcystisaeruginosa; Cd stress

10.3880/j.issn.1004-6933.2017.06.15

国家自然科学基金(51109061，E090301)；水利部公益性行业科研专项(2010010105)；河海大学创新人才计划项目

倪利晓(1973-)，女，副教授，博士，主要从事水环境污染控制与生态修复研究。E-mail：nilixiao@hhu.edu.cn

X172

A

1004-6933(2017)06-0096-06

2016-12-28 编辑：徐 娟)