BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响

于义娟，秦 涛，闵娟娟，漆世华，靖志强，付 娅，李晶梅，廖园园，舒银辉，朱 薇，徐 松，谢红玲

(武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070)

BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响

于义娟，秦 涛，闵娟娟，漆世华，靖志强，付 娅，李晶梅，廖园园，舒银辉，朱 薇，徐 松，谢红玲*

(武汉中博生物股份有限公司，武汉 430070)

为分析BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响，分别用甲醛、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)进行灭活和在-20 ℃进行冻融处理的BHK-21细胞接种裸鼠，通过病理组织形态学观察判定其是否存在致肿瘤的特性。结果显示，甲醛、BEI、BPL、冻融2次或3次分别处理的BHK-21细胞接种裸鼠，对裸鼠致瘤率为零。冻融1次的BHK-21细胞和107、105和103个BHK-21细胞分别接种裸鼠，致瘤率为100%。10个BHK-21细胞接种裸鼠，未见成瘤。试验表明，裸鼠检测BHK-21细胞致瘤性敏感性为103个细胞；冻融2次、甲醛、BEI、BPL处理，BHK-21细胞均丧失致瘤性；冻融1次不能使BHK-21细胞丧失致瘤性。

BHK-21细胞；裸鼠；致瘤性

BHK-21细胞为地鼠肾传代细胞系，具有致瘤性，其完整活细胞具有较高的致癌、致瘤性，不能用于活疫苗的制备[1]。BHK-21细胞灭活后不具有致瘤性，是世界卫生组织推荐的生产兽用疫苗细胞，现已在规模化生产中应用，主要用于口蹄疫灭活疫苗的生产[2]。本研究以《中国兽药典》所载的致瘤性检验方法，对灭活剂、冻融处理的BHK-21细胞进行检验，从中选择能够使BHK-21细胞丧失致瘤性的处理方法，用于兽用生物制品的研发和生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 BALB/c-nu/nu裸鼠，雌性，4～6周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 饲料 裸鼠料，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3 细胞 BHK-21细胞、人宫颈癌细胞系(HELA)细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)，均由武汉中博生物股份有限公司技术中心提供。

1.1.4 试剂 2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)、甲醛、硫代硫酸钠(Na2S2O3)、氢氧化钠(NaOH)均为国产分析纯。取0.4 mol/L的BEA和0.4 mol/L的NaOH等体积混合，37 ℃孵育1 h制成0.2 mol/L的二乙烯亚胺(BEI)。DMEM培养液为HYCLONE公司产品。

1.1.5 仪器 S8智能型独立通气笼IVC(苏州市苏杭科技器材有限公司)、LEICA RM2235石蜡切片机、JK-6 生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司)、水浴锅、离心机、超净台、冰箱、电磁炉。

1.1.6 分组 将裸鼠分为13组，每组10只，见表1。

表1 试验动物分组Tab 1 Experimental animal grouping

1.2 方法

1.2.1 各组接种物的制备

1.2.1.1 细胞悬液的制备 取悬浮培养的对数生长期的BHK-21细胞，1000 r/min离心8 min，弃上清，用DMEM培养液重悬稀释细胞，使细胞浓度为107/0.5 mL、105/0.5 mL、103/0.5 mL、10/0.5 mL。

1.2.1.2 甲醛灭活组细胞的制备 取107/0.5 mL的BHK-21细胞，加入甲醛溶液使终浓度为0.1%，37 ℃灭活72 h。

1.2.1.3 BEI灭活组细胞的制备 取107/0.5 mL的BHK-21细胞，加入BEI溶液使终浓度为0.005 mol/L，37 ℃灭活48 h，加入硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液使终浓度为0.005 mol/L。

1.2.1.4 BPL灭活组细胞的制备 取107/0.5 mL的BHK-21细胞，按1/4000比例加入BPL，2～8 ℃灭活24 h，37 ℃水解2 h。

1.2.1.5 冻融组细胞的制备 取107/0.5 mL的BHK-21细胞，-20 ℃分别冻融1次、2次和3次。

1.2.1.6 HELA细胞和CEF细胞悬液制备 分别取静置培养的对数生长期的HELA细胞和CEF细胞，胰酶溶液消化使细胞分散，离心收集细胞，DMEM培养液重悬，使细胞浓度为106/0.5 mL。

1.2.1.7 阴性对照2组细胞的制备 取107/0.5 mL的BHK-21细胞，置于沸水中煮10 min。

1.2.2 裸鼠接种与观察测量

1.2.2.1 裸鼠接种 按表1选择接种物。在裸鼠颈背部和背部前1/3处，皮下注射，0.5 mL/只。

1.2.2.2 试验观察 观察14 d，检查有无结节或肿瘤形成。如果有结节或可疑病灶，继续观察至少1周，解剖，进行病理组织学检查，检查内脏器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)有无异常病变。对未发生结节的动物，取其中半数，观察21d，对另外半数动物观察12周，对接种部位进行解剖和病理学检查，观察各淋巴结和各器官中有无结节形成，如果可疑，进行病理组织学检查。阳性对照组和阴性对照组观察21 d[3-4]。

1.2.2.3 肿瘤组织切片制备和病理形态学观察 断颈处死裸鼠，取出裸鼠皮下肿瘤结节，用中性福尔马林作常规组织固定，制备石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察。

1.2.2.4 判定标准 在阳性对照组裸鼠成瘤率为100%，阴性对照组裸鼠成瘤率为零时，实验成立。实验组裸鼠无肿物生长或者虽有隆突状肿物生长但却是非肿瘤的，接种物无致瘤性；若有隆突状肿物生长，经病理形态学观察证实为肿瘤的，接种物有致瘤性。

2 结 果

记录各实验组裸鼠精神、饮食、排便、接种部位肿块情况，并对成瘤情况进行统计，见表2。

表2 试验各组成瘤数统计Tab 2 Tumor formation statistics for all groups

2.1 阴、阳性对照组 CEF细胞接种后观察21 d，裸鼠均未见肿块，精神良好，饮食、排便正常(图1)。煮沸10 min的BHK-21细胞接种裸鼠，均未出现肿块，且精神、饮食、排便均没出现异常表现。接种后21 d剖检5只裸鼠，接种后12周剖检5只裸鼠，观察各淋巴结和各器官，均无结节形成(图2)。HELA细胞接种后一周，裸鼠接种部位有肿块形成，肿块直径8 mm左右，具有肿瘤的病理形态(图3)。107个BHK-21细胞接种裸鼠，接种后一周接种部位有肿块形成，肿块数量3个以上，且在背部后方皮下也有肿块形成。肿块直径10～20 mm，肿块质地较软，含血量丰富，具有肿瘤的病理形态。所有裸鼠接种12～14 d全部死亡(图4)。

2.2 冻融组 冻融1组裸鼠在接种后第2周陆续出现肿块，肿块1到2个，肿块直径8 mm左右，具有肿瘤的病理形态，部分肿瘤组织表皮出现破溃，剖检肿块含血量较高，质地较软(图5)。冻融2组均未出现肿块，且精神、饮食、排便均没出现异常表现。接种后21 d剖检5只裸鼠，接种后12周剖检5只裸鼠，观察各淋巴结和各器官，均无结节形成(图6)。冻融3组裸鼠均未出现肿块，且精神、饮食、排便均没出现异常表现。接种后21 d剖检5只裸鼠，接种后12周剖检5只裸鼠，观察各淋巴结和各器官，均无结节形成(图7)。

2.3 灭活剂处理组 甲醛组：1周内有4只裸鼠接种部位有肿块形成，2周肿块消失，21 d剖检，经病理形态学检查，无肿瘤组织。另6只裸鼠没有出现肿块，且精神、饮食、排便均没出现异常表现，21 d剖检3只裸鼠，12周剖检3只裸鼠，观察各淋巴结和各器官，均无结节形成(图8)。BEI、BPL组：裸鼠均未出现肿块，且精神、饮食、排便均没出现异常表现。BEI、BPL组接种后21 d分别剖检5只裸鼠，接种后12周分别剖检5只裸鼠，观察各淋巴结和各器官，均无结节形成(图9、图10)。

2.4 梯度组 梯度1组：接种后一周接种部位有肿块形成，肿块数量2个以上，且在背部后方皮下也有肿块形成。肿块直径8～16 mm，肿块质地较软，含血量丰富，具有肿瘤的病理形态，观察期内没有死亡(图11)。梯度2组：接种后一周均未出现肿块，在接种后2周有8只裸鼠接种部位有肿块形成，在接种3周有2只裸鼠接种部位有肿块形成，肿块直径在4 mm左右，具有肿瘤的病理形态(图12)。梯度3组：裸鼠均未出现肿块，精神、饮食、排便均没出现异常表现。接种后21 d剖检5只裸鼠，接种后12周剖检5只裸鼠，观察各淋巴结和各器官，均无结节形成(图13)。

图1 阴性对照1组裸鼠Fig 1 Negative control group 1

图2 阴性对照2组裸鼠Fig 2 Negative control group 2

图3 阳性对照1组裸鼠Fig 3 Positive control group 1

图4 阳性对照2组裸鼠Fig 4 Positive control group 2

图5 冻融1组裸鼠Fig 5 Freezing-thawing group 1

图6 冻融2组裸鼠Fig 6 Freezing-thawing group 2

图7 冻融3组裸鼠Fig 7 Freezing-thawing group 3

图8 甲醛组裸鼠Fig 8 Formaldehyde treatment group

图9 BEI组裸鼠Fig 9 BEI treatment group

图10 BPL组裸鼠Fig 10 BPL treatment group

图11 梯度1组裸鼠Fig 11 Gradient group 1

图12 梯度2组裸鼠Fig 12 Gradient group 2

图13 梯度3组裸鼠Fig 13 Gradient group 3

2.5 HELA细胞致瘤裸鼠肿瘤病理学观察 采集裸鼠皮下肿瘤结节，进行组织切片制备和病理形态学观察。细胞排列紊乱，失去正常的排列层次，细胞大小不一(图14)。有些细胞体积偏大，细胞核与细胞质的比例增大，细胞核形态大小不一，染色质粗糙，出现病理性核分裂象(图15)。

图14 HELA细胞致瘤 HE 200×Fig 14 Tumor caused by Hela cells HE 200×

→：病理性核分裂相→：Pathological mitotic phase图15 HELA细胞致瘤 HE 400×Fig 15 Tumor caused by Hela cells HE 400×

2.6 BHK-21细胞致瘤裸鼠肿瘤病理学观察 采集各肿块，制备石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察，结果见图16、图17。

图16 BHK-21细胞致瘤 HE 200×Fig 16 Tumor caused by BHK-21 cells HE 200×

→：病理性核分裂相→：Pathological mitotic phase图17 BHK-21细胞致瘤 HE 400×Fig 17 Tumor caused by BHK-21 cells HE 400×

结果显示，肿块大部分区域为坏死的肿瘤组织，肿瘤细胞如横纹肌母细胞样弥漫分布，可见病理性核分裂象。

3 讨 论

本试验中使用的甲醛、BPL、BEI属于化学灭活剂。化学灭活的优点是效果确实、方法简便。甲醛灭活的作用机制是破坏微生物的核酸及蛋白质。甲醛灭活时首先与含氨基的核苷酸碱基(如A、G、U)结合而使核酸变性。使用较高浓度的甲醛和较长时间的作用时间，甲醛可与蛋白质的胺基结合，形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，后者再与酰胺发生交联反应。微生物的蛋白质发生变性，阻止其核酸逸出[5-6]。甲醛灭活存在较多的缺陷，包括刺激性大、致癌危险、破坏免疫原性、灭活时间长、灭活效果受多种因素影响等[7]。BPL灭活的作用机制是作用于微生物的DNA或RNA，通过与核酸的嘌呤碱基(主要是G)反应破坏核酸的结构，但不直接作用于蛋白质，因此能保持良好的免疫原性。大剂量BPL是一种潜在致癌物，但是BPL极易水解，在37 ℃水浴水解2 h后消失，其水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸。BPL灭活的另一优势是灭活所需时间短，能显著缩短疫苗生产周期[5]。BEI灭活的作用机制是烷化微生物DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋链交联及干扰酶系统和核蛋白作用，破坏核酸代谢、合成，导致微生物核酸芯破坏。BEI破坏微生物核酸，不作用于蛋白质，能较好的保持抗原的免疫原性[5]。本试验中使用冻融处理BHK-21细胞。冻融是一种破碎细胞的方法，作用机理是突然冷冻时细胞内形成冰晶，细胞内外溶剂浓度突然改变致使细胞破碎[8]。

本试验用裸鼠检测细胞致瘤性，裸鼠胸腺先天性缺陷，T淋巴细胞缺损，适于免疫生物学、免疫病理学、移植免疫等研究，是生物制品传代细胞致瘤试验的最好动物模型[9]。裸鼠皮下接种肿瘤细胞，可导致其产生肿瘤或组织癌变，且保持原发瘤的组织学形态、免疫学特点及其特有的染色体组型[10]。

细胞染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性，不同核型细胞致瘤性不同[11-12]。对BHK-21细胞系KA株、M株、YA株的染色体组型与遗传变异率分析，研究发现BHK-21细胞皮下接种裸鼠均产生进行性生长的恶性肿瘤，且不论核型如何始终具有强的致癌性[12]。染色体数目变异越大，染色体众数越多、范围越宽，染色体条数越多，致瘤性越强。可能是因为“优胜劣汰”作用导致染色体数目变异较小细胞在裸鼠体内增殖处于劣势或被淘汰，相反染色体数目变异较大细胞在裸鼠体内增殖处于优势而明显增多[13-14]。李六金等学者研究BHK-21细胞致瘤性，结果显示108BHK-21细胞和107BHK-21细胞不论是低代次还是高代次的肿块形成率和致瘤率均为100%，且代次之间差异不显著。正常BHK-21细胞经快速裂解后仍具有致瘤性[1]。

本试验用裸鼠检测BHK-21细胞致瘤性，结果显示，103个BHK-21细胞接种裸鼠引发肿瘤；10个BHK-21接种裸鼠观察期内未见肿瘤。本试验结果表明，BHK-21细胞的数量及密度对裸鼠的致瘤性有明显影响，裸鼠检测BHK-21细胞致瘤性敏感性为103个细胞。

本试验对BHK-21细胞进行-20 ℃冻融1次处理后，进行裸鼠致瘤性试验观察。结果显示皮下接种裸鼠引发肿瘤，且重复性稳定，这和李六金等学者的正常BHK-21细胞经快速裂解后仍具有致瘤性的结论相符。

本试验对BHK-21细胞分别进行甲醛37 ℃灭活72 h、BEI 37 ℃灭活48 h、BPL 4 ℃灭活24 h、-20 ℃冻融2次或3次处理后，进行裸鼠致瘤性试验观察。结果显示，甲醛、BEI、BPL、-20 ℃冻融2次或3次后，皮下接种裸鼠均不引发肿瘤。结果表明，兽用灭活疫苗若以BHK-21细胞作为病毒增殖载体收获的抗原液，经2次冻融处理或0.1%甲醛或0.005 mol/L的BEI或1/4000的BPL进行灭活，均能使BHK-21细胞丧失致瘤性。

综上所述， BHK-21细胞经灭活和冻融处理可丧失对裸鼠的致瘤性，其结果可以作为判定BHK-21细胞是否适用于兽用灭活疫苗抗原生产的参考依据。

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(编辑：李文平)

EffectsofDifferentTreatmentsofBHK-21CellsonTumorigenicityinNudeMice

YU Yi-juan, QIN Tao, MIN Juan-juan, QI Shi-hua, JING Zhi-qiang, FU Ya, LI Jing-mei,
LIAO Yuan-yuan, SHU Yin-hui, ZHU Wei, XU Song, XIE Hong-ling*

(WuhanChopperBiologyCo.,Ltd,Wuhan430070,China)

XIEHong-ling,E-mail: 13419546263@163.com

For understanding the tumorigenicity of BHK-21 cells, nude mice were injected by BHK-21 cells which inactivated by formaldehyde, diethylenimine (BEI), β-propiolactone (BPL) as well as BHK-21 cells which freezing-thawing at -20 ℃, the tumor-bearing characteristics were observed by pathomorphological changes. The results showed that the tumor morbidity of BHK-21 cells were treated by formaldehyde, BEI, BPL and freezing-thawing for two or three times were zero, 107,105,103BHK-21 cells can 100% cause the tumors as well as the BHK-21 cells were freezing-thawing only once, no tumors were found when the dose of injection is ten. These results suggested that the sensitivity of tumorigenicity of BHK-21 cells in nude mice was 103cells, the tumorigenicity of BHK-21 cells can be killed with freezing-thawing for twice, formaldehyde, BEI and BPL; but it still have tumorigenicity in nude mice with freezing-thawing only once.

BHK-21 cells；nude mice; tumorigenicity

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.05

2017-02-23

A

1002-1280 (2017) 11-0028-08

Q813

于义娟，硕士，从事兽用疫苗研发和动物组织病理检测研究。

谢红玲。E - mail：13419546263@163.com