高效液相色谱法测定蒙成药五味沙棘颗粒中栀子苷含量

耿 婕，那顺朝克图 ，丛丽华 ，樊精辉，赵春雨，薛培凤

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110； 2.内蒙古宇航人药业有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 011517）

高效液相色谱法测定蒙成药五味沙棘颗粒中栀子苷含量

耿 婕1，那顺朝克图1，丛丽华2，樊精辉2，赵春雨1，薛培凤1

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110； 2.内蒙古宇航人药业有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 011517）

目的 建立测定蒙成药五味沙棘颗粒中栀子苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 色谱柱为Thermo Scientific ODS－2 Hypersil柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为乙腈－0.5%磷酸，梯度洗脱，流速为 1 mL／min，柱温为 25℃，进样量为20 L，检测波长为237 nm。结果 栀子苷进样量在 0.144～1.44 g范围内与峰面积线性关系良好（r＝0.999 9），平均加样回收率为 96.11%，RSD＝0.74%(n＝6)。结论 该方法操作便捷，准确度高，重复性好，适用于测定蒙成药五味沙棘颗粒中栀子苷的含量。

高效液相色谱法；五味沙棘颗粒；栀子苷；含量测定

五味沙棘颗粒由蒙古族清热祛痰验方五味沙棘散经剂型改革而来，由木香、甘草、白葡萄干、沙棘膏、栀子5味药材组方，有清热祛痰、止咳定喘功效，用于肺热久咳、胸中满闷、胸胁作痛、慢性支气管炎见上述证候者[1－2]。原剂型五味沙棘散对慢性支气管炎模型小鼠的炎性病变有显著改善作用，对小鼠免疫功能有增强作用[3]，对慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的肺部病变也有改善作用[4－6]。原剂型五味沙棘散的法定质量标准收载于2010年版及2015年版《中国药典（一部）》，含量测定项下均为高效液相色谱（HPLC）法测定其中木香烃内酯和去氢木香烃内酯含量[7－8]。也有学者建立了测定其中栀子苷含量的HPLC法[9－11]。五味沙棘颗粒现行质量标准仅为企业对该药的注册标准，为制订该蒙药制剂的质量标准，有效控制产品质量，课题组前期研究建立了测定其中异鼠李素含量的HPLC法[12]。栀子为本方之佐使药，对该制剂的质量具有重要作用，其主要有效成分栀子苷具有清肝利胆、消炎镇痛等多种生物学效应和广泛的药理作用[13－15]，但尚无关于该制剂中栀子苷含量测定方法的研究报道。为此，本研究中建立了测定五味沙棘颗粒中栀子苷含量的HPLC法，为该制剂的质量标准制订提供了科学依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器（DAD）及 Empower色谱工作站（美国 Waters公司）；Thermo Scientific ODS－2 Hypersil色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技公司）；KQ －250DA型数控超声清洗器（250 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；IKA RV10型旋转蒸发仪（德国 IKA公司）；AL204型万分之一电子分析天平（瑞典Mettler Toledo公司）；AB135－S型万分之一电子分析天平（梅特勒－托利多仪器＜上海＞有限公司）。

1.2 试药

流动相所用乙腈为色谱纯（Fischer公司）；水为超纯水（实验室自制）；甲醇和磷酸均为分析纯（天津市化学试剂三厂）；栀子苷对照品（纯度≥98%，成都植标纯化生物技术有限公司，批号为130527）；五味沙棘颗粒（批号 分别 为 20110102，20110201，20110401，20110701，20130201，20131101，规格均为每袋 6 g），缺栀子五味沙棘颗粒，均购自内蒙古宇航人药业有限责任公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Scientific ODS－2 Hypersil色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 － 0.5% 磷酸，洗脱梯度见表 1；检测波长：237 nm；流速：1 mL ／min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

表1 流动相梯度变化

2.2 溶液制备

对照品溶液：取适量栀子苷对照品，精密称定，加90%甲醇，制成栀子苷质量浓度为0.422 g／L的溶液，微孔滤膜滤过，即得。

供试品溶液：取五味沙棘颗粒1.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加90%甲醇100 mL，密塞，超声15 min，滤过，以相同甲醇洗涤药渣及滤器，每次10 mL，洗涤3次，合并滤液及洗液，蒸干溶剂，用相同甲醇将残渣转溶至25 mL容量瓶中，定容，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。

阴性对照品溶液：按该制剂注册标准的处方和制备工艺制备缺栀子的五味沙棘颗粒，再按供试品溶液制备方法制备缺栀子的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2项下3种溶液各20 μL，按2.1项下色谱条件分别进样分析。结果，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应保留时间处有相应的色谱峰，而阴性对照品溶液在此处无相应色谱峰，色谱图见图1。表明阴性对照无干扰，本方法专属性良好。

线性关系考察：取2.2项下对照品溶液，加90%甲醇稀释成质量浓度为0.072 g／L的栀子苷溶液，精密吸取 2，4，8，12，16，20 μL，按 2.1 项下色谱条件进样分析，并以峰面积（Y）对进样量 （X，μg）进行线性回归，得回归方程 Y＝1.4×106X＋25 973，r＝0.999 9（n＝6）。结果表明，栀子苷进样量在 0.144 ～ 1.44 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

图1 专属性试验高效液相色谱图

精密度试验：按2.2项下同一对照品溶液，进样6次，测定峰面积。结果的 RSD为 0.17%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：按2.2项下方法制备同一供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样，测定峰面积。结果的 RSD为 0.22%（n＝6），表明供试品溶液在 24 h内稳定。

重复性试验：分别取五味沙棘颗粒（批号为20110701）6份，按2.2项下方法平行制备供试品溶液，分别进样分析，测定峰面积，代入线性回归方程，计算得栀子苷含量。结果平均含量为 0.649 9 mg／g，RSD为1.14%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别取五味沙棘颗粒（批号为20110701）6 份，各约 0.66g，精密称定，分别加入 0.422mg栀子苷对照品，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样分析，测定峰面积，代入线性回归方程，计算栀子苷的回收率，结果见表2。

2.4 样品含量测定

取6批次五味沙棘颗粒各1.33 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样分析，测定峰面积，代入线性回归方程，计算栀子苷的含量。结果见表3。

表2 栀子苷加样回收试验结果（n＝6）

表3 不同批次五味沙棘颗粒的含量测定结果（n＝6）

3 讨论

3.1 提取方法和提取溶剂的选择

本研究中采用单因素法对提取方法（超声和回流）、提取溶剂（甲醇和乙醇）进行考察，结果表明，超声提取和回流提取的提取率无明显差异，甲醇提取和乙醇提取无明显差异，考虑到超声提取更简单便捷，乙醇提取更环保安全，故选择乙醇超声提取。

3.2 提取工艺的优化

本研究中以正交试验法 L9（33）对提取工艺进行优化，考察了提取溶剂的体积分数（50%，70%，90%）、用量（25，50，100 mL）以及提取时间（15，30，45 min）等关键因素，以提取率为主要依据，确定最佳提取工艺为加90%乙醇100 mL，超声提取15 min。

3.3 流动相的选择

本试验中对以乙腈－水，乙腈－0.5%磷酸、乙腈－1.0%磷酸和甲醇－0.5%磷酸为流动相的色谱分离效果分别进行了考察，结果表明，以乙腈－0.5%磷酸为流动相，分离效果较好，故选择其为流动相梯度洗脱。

经以上选择及优化过程，本试验中建立了测定五味沙棘颗粒中栀子苷含量的HPLC法，为制订和完善五味沙棘颗粒的质量标准提供了试验依据。

[1]白清云.中国百科全书·蒙医学[M].上海：上海科学技术出版社，1992：267.

[2]苏日娜 .五味沙棘散研究进展[J].北方药学，2012，9（5）：103－104.

[3]包桂兰，于丽君，翟景波，等.五味沙棘散对慢性支气管炎模型抗炎和免疫作用的研究[J].中药药理与临床，2012，28（5）：58.

[4]布林白拉，斯琴塔娜，奥登塔娜，等.蒙药沙棘五味散对慢性阻塞性肺病模型的作用[J].亚太传统医药，2016，12（24）：11－12.

[5]包桂兰，杜智敏，赵中华，等.五味沙棘散对慢性支气管炎动物模型的作用及急性毒性的研究[J].现代中西医结合杂志，2009，18（5）：482 － 483.

[6]包桂兰，杜智敏，赵中华，等.五味沙棘散止咳祛痰平喘作用的实验研究[J].现代中西医结合杂志，2009，18（3）：243 －244.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：535.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：616 －617.

[9]刘 敏，周桂华，卢全德.高效液相色谱法测定五味沙棘散中栀子苷的含量 [J].中国医院药学杂志，2008，28（20）：1803－1804.

[10]拉喜那木吉拉，巴根那.HPLC测定蒙药五味沙棘散中栀子苷含量[J].中国现代中药，2007，9（6）：18 －20.

[11]刘峰群，韩 晋，袁海龙，等.吸附小柱－高效液相色谱法测定五味沙棘散中栀子苷的含量[J].中草药，2001，32（3）：28－29.

[12]耿 婕，薛培凤，赵子龙，等.高效液相色谱法测定五味沙棘颗粒中异鼠李素含量[J].中国药业，2013，22（21）：27 －28.

[13]孟祥乐，李红伟，李 颜，等.栀子化学成分及药理作用研究进展[J].中国新药杂志，2011，20（11）：959 － 967.

[14]刘益华，李 晶，林曼婷，等.栀子有效成分栀子苷的现代研究进展[J].中国药学杂志，2012，47（6）：406 －409.

[15]游伟良，平其能，孙敏捷，等.栀子苷的药理学研究新进展[J].药学进展，2012，36（4）：158 － 162.

Content Determination of Geniposide in Wuweishaji Granules of M ongolian Patent Medicine by HPLC

Geng Jie1， Nashun Chaoketu1， Cong Lihua2， Fan Jinghui2， Zhao Chunyu1， Xue Peifeng1
（1.School of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot， Inner Mongolia， China 010110； 2.Inner Mongolia Yuhangren Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hohhot，Inner Mongolia，China 011517 ）

Objective To establish an HPLC method for determination of geniposide in Wuweishaji Granules.M ethods The chromatographic column was Thermo scientific ODS－2 Hypersil column （250 mm ×4.6 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile －0.5% phosphoric acid，gradient elution，the flow rate was 1 mL ／min，the temperature was 25 ℃ ，the sample injection was 20 μL，and the detection wavelength was 237 nm.Results The geniposide showed good linear of 0.144 － 1.44 μg（ r＝ 0.999 9），the average recovery rate was 96.11% ，and theRSD was 0.74% （n ＝ 6）.Conclusion The method is convenient，accurate and reproducible.It is suitable for the determination of geniposide in Wuweishaji Granules of Mongolian patent medicine.

HPLC；Wuweishaji Granules；geniposide；content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)22－0021－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.22.007

内蒙古自治区“草原英才”工程项目[内组通字〔2014〕27号]。

耿婕，女，汉族，硕士研究生，研究方向为中蒙药药效物质基础及质量控制，（电话）0471－6653178（电子信箱）gebi＿888＠ 163.com。

薛培凤，女，汉族，博士研究生，教授，研究方向为中蒙药药效物质基础及质量控制，（电话）0471－6653146（电子信箱）xpfdc＠ vip.sina.com。

2017－06－06；

2017－06－25)