煤矸石充填不同复垦年限土壤细菌群落结构及其酶活性
2017-11-23侯湖平李金融丁忠义张绍良杨永均
侯湖平,王 琛,李金融,丁忠义,张绍良,黄 磊,董 健,马 静,杨永均
煤矸石充填不同复垦年限土壤细菌群落结构及其酶活性
侯湖平,王 琛,李金融,丁忠义,张绍良*,黄 磊,董 健,马 静,杨永均
(中国矿业大学环境与测绘学院,江苏徐州 221116)
基于徐州市3块煤矸石充填复垦地(复垦时间分别为2015、2010和2001年)的土壤样本,采用Illumina PE250测序方法测定微生物群落组分,以未受采煤塌陷影响区的土壤样本为对照地,对比分析充填复垦区细菌群落的垂直结构及其时间变化.结果表明:(1)与对照地相比,复垦土壤在各个分类水平的细菌种类数量减少,群落多样性降低.随着复垦年限的增加,复垦地与对照地的贴近度越高.(2)厚壁菌门、变形菌门是复垦土壤中门水平的优势菌,厚壁菌门在复垦土壤中优势地位上升,有从20~40cm土层向0~20cm土层转移的趋势.(3)芽孢杆菌纲在纲水平占绝对优势,在复垦土壤0~20cm土层中的数量多于对照土壤,在复垦土壤20~40cm土层的数量随年限增加而减少.(4)乳杆菌目、芽孢杆菌目在目水平是优势菌,除硫单胞菌目对重金属污染修复有重要作用,然而在复垦土壤的0~20cm土层中的数量比正常农田土壤少74.81%~99.59%.(5)芽孢杆菌科、肠球菌科、链球菌科是科水平的优势菌,芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属是属水平的优势菌,芽孢杆菌属-JH7、屎肠球菌、乳球菌属-piscium是种水平的优势菌,3大类在复垦土壤中的数量比例大于正常农田,且在0~20cm土层中的差别更明显,在复垦土壤的20~40cm土层的数量随年限增加而减少.(6)脱氢酶活性与厚壁菌门下的多种细菌的数量呈显著负相关,与放线菌门的数量呈显著正相关,与γ-变形菌纲的数量呈极显著正相关.随着复垦年限的增加,土壤优势菌群的类型没有变化,但是数量结构在变化.厚壁菌门在缺水和极端环境下适合生长,变形菌门有助于土壤氮素以及能量的循环.采用微生物修复技术,调整土壤细菌群落结构,可以改善土壤质量,缩短土壤恢复年限.
煤矸石充填复垦；微生物群落；细菌群落；复垦年限；徐州矿区
煤炭资源开发在促进经济发展的同时,对生态环境也产生巨大的负效应,煤矸石堆积与土地沉陷是其中的问题之一.煤矸石充填复垦是处理煤矸石问题之一,它是以煤矸石为充填物并在上面填充土壤,使其土地达到可供利用状态的复垦模式.该模式一方面解决煤矸石压占土地的问题,另一方面,降低煤矸石对大气、土壤和水等造成的一定程度污染,在我国被广泛应用[1].但是,复垦后的农田与未受采煤塌陷的正常农田相比,土壤理化性质和土壤微生物群落的结构特征发生变化[2-4],进而影响着复垦后耕地的质量.土壤细菌群落结构特征和变化规律能够反映矿区复垦土壤微生物群落多样性和生态功能,反应土壤复垦水平和质量[5-8].
国内外学者对矿区复垦土壤中的微生物进行研究,主要有以下几个方面:一是针对复垦土壤微生物的生物量及其数量进行研究,分析复垦前后不同复垦年限、不同植被模式下土壤细菌、真菌、放线菌的生物量及其数量变化[10-13].二是对复垦土壤中细菌群落多样性的研究,包括不同复垦年限煤矸石填埋场的土壤微生物特性[3],对不同复垦植被类型和复垦年限对土壤细菌群落多样性的影响[14],土壤pH值变化对复垦土壤细菌群落多样性以及细菌门结构特征的影响[15].三是对细菌群落结构中优势菌群的研究,诸如中国东部矿区不同复垦植被类型和不同复垦时间土壤细菌的优势菌及其多样性[16],我国准格尔地区煤矿不同复垦时间土壤细菌组成及其多样性的变化[17].四是对复垦土壤中微生物量和土壤养分的相关性研究,诸如昆阳磷矿不同年限和不同植被的矿山恢复土壤的理化性状和微生物的相关性[18],研究采石场不同开采模式和土壤恢复模式对土壤微生物群落的活性、生物量和遗传结构的影响[5].这些研究多针对复垦土壤中的微生物活动情况,但是对于煤矸石充填复垦土壤中细菌群落的研究不够深入.本研究以徐州不同复垦年限的煤矸石复垦地为研究对象,研究复垦区土壤0~20cm和20~40cm深度的土壤样本,采用Illumina PE250测序方法,测定土样中细菌门、纲、目、科、属、种6个水平的序列数,研究煤矸石充填复垦土壤细菌群落的结构、多样性及其酶活性,目的在于分析煤矸石充填复垦地不同复垦年限土壤细菌群落的变化特征,为采用微生物修复措施提高复垦地质量提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于江苏省徐州市西北部的煤矿开采区,属于华东高潜水位平原区,属暖温带半湿润季风气候区,四季分明.年气温13.8℃,年日照时数为2284~2495h,日照率为52%~57%,年均无霜期200~220d,年均降水量800~930mm,年均湿度72%.气候资源丰富,适宜农作物生长,为我国华东地区重要粮食产区.该区域正常水旱轮作地的地下水位在(0.80±0.20)m,正常旱地地下水位在1.0m以下.受采煤影响,研究区复垦前最大沉陷量1~1.5m,最小沉陷量0.6m,平均沉陷量1.1m,大部分塌陷地出现积水,农田绝产.
煤矸石充填前,首先将积水清理,然后表土层剥离,采用统一矸石分层振压回填复垦,充填煤矸石4.6m,压实度为85%,覆土厚度为50cm.经检测,煤矸石有毒元素的平均含量分别为:Hg为0.104mg/kg(标准值为0.15mg/kg),Cd为0.086mg/ kg(标准值为0.2mg/kg),Pb为29.73mg/kg(标准值为35mg/kg),As为9.25mg/kg(标准值为15mg/kg),该含量均符合我国土壤的可接受水平[19].
在研究区内选取3块不同复垦年限的煤矸石充填复垦地,并在每块复垦地附近1km以内选取未受采煤塌陷影响的正常农田作为对照地,对照地与复垦地具有相同的种植作物种类和施肥管理方式.第1块复垦地S(116°48′44″E, 34°48′47″N),复垦年限为1年,对照地SC (116°48′36″E,34°48'25″N);第2块复垦地M (117°23′48″E,34°21'25″N),复垦年限为6年,对照地MC(117°23′36″E,34°21′05″N);第3块复垦地L(117°08′22″E,34°25' 24″N),复垦年限为15年,对照地LC(117°08′33″E,34°25'25″N).复垦地和对照地的地面作物以种植玉米和大豆为主,一年两熟制,作物长势良好.土壤以黄河冲积物为其母质发育而成,土壤类型为普通褐土,土壤pH6~7呈弱酸性,土壤电导率为652.1~664.3μS/cm,属于正常的盐分浓度范围.
1.2 土壤样本采集
采样时间为2016年6月.每块样地以S型采样,利用无菌取土器取0~20cm和20~40cm深度的土壤样品各约1kg,共采样12个点,每个点取样取5次重复,然后混合作为样本.将一部分新鲜土样研磨过2mm筛后,置于-20℃冰箱中保存待用,3d内进行土壤微生物指标分析;另一部分土样进行自然风干,研磨处理,过0.149mm筛后,用于土壤理化性质和酶活性指标分析.
1.3 土壤细菌的16S rRNA 基因测序
1.3.1 DNA提取和PCR扩增 利用E.Z.N. A.Soil DNA试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取12个土壤样本DNA.针对细菌的16S rRNA的V4-V5区进行PCR扩增.使用的兼并引物为:515F 5’-barcode-GTGCCAGCMGC- CGCGG)-3’和907R 5’-CCGTCAATTCMTTT- RAGTTT-3’.PCR,扩增程序如下:95℃预变性2min,随后95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共25个循环;最后72℃最终延伸5min结束. PCR反应在一式3份的20μL含有4μL 5×FastPfu缓冲液,2μL 2.5m dNTP,0.8μL每种引物(5μmol/ L),0.4μL FastPfu聚合酶和10ng模板DNA的混合物中进行.从2%琼脂糖凝胶中提取扩增子,并利用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,U.S.)进行纯化,并使用QuantiFluor TM-ST(Promega,U.S.)进行定量.实验过程中,每个样本进行3个重复.
1.3.2 文库的构建及测序 纯化的PCR产物通过Qubit®3.0(Life Invitrogen)定量,并且序列不同的每12个扩增子混合均匀.在Illumina的基因组DNA文库制备程序之后,将汇集的DNA产物用于构建Illumina Pair-End文库.然后根据标准方案在Illumina MiSeq平台(上海BIOZERON有限公司)上对扩增子文库进行配对终点测序(2×250).原始读取存储在NCBI序列读取存档(SRA)数据库中.
1.4 数据处理
1.4.1 原始数据处理与样本序列数目统计 使用QIIME(1.17版本)对原始fastq文件进行质量过滤:在任何平均质量评分小于20的位点,在10bp滑动窗口上截断250bp读数,丢弃短于50bp的截断读数.精确条码匹配,引物匹配中的2个核苷酸不匹配,去除包含模糊字符的读数.根据重叠序列仅组装长度大于10bp的序列,无法组装的读数被丢弃.使用UPARSE(版本7.1)将操作单位(OTU)聚类为具有97%的相似性截断,并使用UCHIME鉴定和去除嵌合序列.通过使用70%的置信阈值的RDP分类器[20],对silva(SSU123)16S rRNA数据库分析每个16S rRNA基因序列的系统发生亲缘关系.
1.4.2 生物信息学分析 基于Mothur v.1.21.的分析[21],计算Shannon和Chao多样性指数[22].使用UniFrac进行β多样性分析[23],比较使用群落生态包R-forge的主成分分析(PCA)的结果,使用SPSS(ver.22.0)软件通过平均连结的聚类技术对从RDP分类器获得的门进行聚类,利用基于Spearman的方法计算相关性系数,用OriginPro (ver.9.0)进行绘图.
2 结果与分析
2.1 复垦地与对照地土壤细菌群落结构的对比分析
2.1.1 细菌群落多样性分析 由表1可知,复垦土壤中细菌群落在各个分类水平的细菌种类数量都少于对照地,但是在不同复垦年限中,细菌种类数量的变化规律性不强.细菌群落多样性和物种丰富度降低,Shannon、Chao指数(图1)在0~20cm土层中复垦地比对照地降低33.39%~ 66.94%和34.75%~85.32%,在20~40cm土层中复垦地比对照地降低13.41%~65.62%和12.43%~ 84.80%.可见,经过煤炭资源开采、土地塌陷、煤矸石充填复垦工程等严重扰动后,土壤细菌群落在1年内立即产生响应,煤矸石充填复垦后的土壤细菌群落的数量减少,直到复垦15年后细菌群落多样性仍未完全恢复,并且在0~20cm深度比在20~40cm深度的变化更剧烈.随着复垦年限增加,20~40cm土层的群落多样性指数增加,因为随着时间的推移,微生物生存环境不断改善,细菌群落多样性呈现变好的趋势.
表1 样本中的细菌种类数
图1 97%相似度水平下不同土层的细菌群落Chao、Shannon指数
采用行聚类分析法对12个样本的土壤细菌群落在门水平的序列数进行聚类,结果如图2所示.当聚类分为2类时,分别为复垦地样本S、M、L聚为一类,SC、MC、LC样本聚为一类,说明了复垦土壤细菌群落结构和对照土壤细菌结构之间的差异明显.
2.1.2 土壤优势菌分析 在复垦土壤中,各样本中占主要数量比例的细菌序列数统计见表2.从物种组成来看,复垦地与对照地比较,复垦细菌群落构成相对简单,呈现物种数量少,丰富度低.本结论和Poncelet等[2]、马守臣等[3]、李媛媛等[24]、钱奎梅等[25]的结果类似.可见,矿区经过煤矸石充填复垦工程扰动后,土壤生态环境受到严重影响,土壤微生物多样性有降低的趋势.但是,随着复垦年限的增加,植物生长导致土壤有机质含量上升,为微生物的生长和繁殖提供有利条件,复垦土壤的多样性指数、丰富度指数会有提高的趋势,这一结论与樊文华等[13]、钱奎梅等[25]对不同复垦年限对土壤微生物多样性的影响研究一致.随着复垦年限的增加,复垦土壤中的细菌优势菌种不变,都是以厚壁菌门和变形菌门为主,但是数量比例略有变化.
图2 不同样本细菌群落聚类
表2 土壤中主要细菌的序列数
在门水平,复垦土壤和对照土壤中的优势菌均为厚壁菌门和变形菌门,二者在复垦土壤中共占87.56%~93.96%,在对照土壤中共占64.22%~ 69.37%.在纲的水平上,芽孢杆菌纲占绝对优势,在复垦土壤中相对丰度为64.55%~76.24%,然而在对照地土壤中为25.01%~35.25%.在目水平上,乳杆菌目、芽孢杆菌目共占64.55%~75.84%.在科水平上,复垦土壤中的芽孢杆菌科肠球菌科链球菌科共占58.75%~69.70%.在属水平上,复垦土壤的芽孢杆菌属肠球菌属乳球菌属共占57.65%~68.37%.在种水平上,芽孢杆菌属-JH7、屎肠球菌乳球菌属-piscium是优势菌种,在数量上共占54.79%~65.12%.
复垦土壤中几乎所有细菌门的数量比对照地少,但是厚壁菌门在复垦土壤中的数量比例大于对照地土壤,在复垦土壤0~20cm和20~40cm土层中的数量分别比对照地土壤多155.96%~ 614.01%和4.06%~241.73%.厚壁菌门有从20~ 40cm土层向0~20cm土层转移的趋势.芽孢杆菌纲属于厚壁菌门,在复垦地中的数量大于对照地,在0~20cm土层中的数量比对照地多191.04%~ 764.03%,差别更明显,其在复垦土壤的20~40cm土层的数量随年限增加而减少.乳杆菌目、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、肠球菌科、链球菌科、类芽孢杆菌科属于芽孢杆菌纲,在复垦地中的数量大于对照地,在0~20cm土层中的差别更明显,复垦土壤中的数量分别比对照地多197.27%~ 826.72%、147.74%~703.36%、159.92%~751.21%、202.10%~812.17%、194.24%~846.47%、113.73%~536.51%.属和种水平,厚壁菌门下的芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属-JH7、屎肠球菌、乳球菌属-piscium均有同样的分布特征,在复垦地的数量大于对照地,在0~ 20cm土层中的差别更明显,复垦土壤中的数量分别比对照地多173.06%~754.78%、202.10%~ 812.17%、194.24%~846.47%、197.46%~765.10%、202.10%~812.17%、197.63%~45.74%.上述细菌目、科、属、种在复垦土壤的20~40cm土层的数量均随年限增加而减少.
变形菌门下的-变形菌纲、-变形菌纲、-变形菌纲在复垦土壤中数量均小于对照地,分别少13.02%~34.04%、3.42%~98.54%、3.14%~ 97.52%.-变形菌纲下的肠杆菌目、肠杆菌科在复垦地中的数量大于对照地,在0~20cm土层中的差别更明显,复垦土壤中的数量分别比对照地多162.79%~756.89%和162.79%~181.96%.-变形菌纲下的除硫单胞菌目在复垦地中的数量比对照地少34.39%~98.84%,在研究区复垦土壤中的含量低于正常水平.
放线菌门作为高G+C革兰氏阳性菌,能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂.而在研究区的复垦地土壤中,20~40cm土层的数量比对照地少19.18%~97.04%.
2.2 不同复垦年限土壤细菌群落结构的对比
通过分析不同样本OTU(97%相似性)组成,对3组样地的土壤细菌群落数据进行主成分分析(PCA),不同环境间的样本表现出分散或聚集的分布情况(图3).PC1轴的可信度为97.12%, PC2轴的可信度为1.01%,累计贡献率达98.13%.在PC1轴上,复垦地土壤样本与对照地土壤样本从PC1的0值位置显著分离,表明煤矸石充填复垦后土壤细菌群落结构发生较大变化,此结果与不同样品间的聚类分析结果一致.同时,不同复垦年限对土壤微生物的影响差异在PC1轴和PC2轴上均有较好的体现,复垦地样本L和LC距离最远,M和MC样本次之,S和SC样本距离最近,表明随着时间的推移,复垦土壤的微生物群落结构组成会逐渐发生变化,与对照地土壤中的微生物群落结构将偏离正常土壤的水平.
图3 土壤样本主成分分析
2.3 细菌群落优势菌和脱氢酶的相关性分析
土壤酶在土壤生态系统的物质循环和能量转化过程中有重要作用[26].土壤酶活性能表征土壤的综合肥力特征及土壤养分转化进程[27-29].已有研究表明,土壤酶和土壤微生物之间存在相互促进和制约的复杂关系[30].由于作物和微生物的分泌物及对其残体的分解物是土壤酶的主要来源,增加土壤中微生物的含量,有利于提高土壤的酶活性,土壤酶与土壤细菌的相互作用能够推动土壤有机质的矿化分解和养分循环转化.因此,土壤酶活性能够敏感地反映土壤微生物的活性状况,在复垦土壤中起到重要的生态指示作用.本研究中测得土壤中脱氢酶活性(图4),在复垦土壤和对照土壤中,脱氢酶活性均表现出0~20cm土层的含量大于20~40cm土层,在复垦土壤中多出1.62%~9.43%,在对照土壤中多出4.35%~17.49%,土壤脱氢酶含量在不同土层的分布上总体呈现出随土壤深度的增加而递减的规律.用复垦样本数据除以对照样本,得到的百分数可以表示复垦地土壤相比对照土壤的贴近度.经过计算,0~ 20cm土层的S、M、L样本的贴近度分别为83.76%、86.05%、89.57%,呈现L>M>S的规律.此数据表明,采煤塌陷与复垦工程改变了土壤脱氢酶活性及其分布,随着复垦年限增加,土壤脱氢酶活性正逐步恢复到正常土壤.20~40cm土层的S、M、L样本的贴近度分别为89.93%、88.31%、91.98%,说明复垦年限的变化对20~40cm的土层酶活性没有明显的影响.
图4 土壤样品中脱氢酶含量
土壤脱氢酶的活性能表征土壤微生物的氧化能力,可以作为微生物氧化还原系统的指标[31].细菌群落优势菌和脱氢酶的相关性见表3,土壤中脱氢酶活性与厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、芽孢杆菌目,芽孢杆菌科、链球菌科、肠球菌科、芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属-JH7、屎肠球菌和乳球菌属-piscium成显著负相关,与放线菌门成显著正相关,和γ-变形菌纲成极显著正相关,说明土壤中脱氢酶活性与土壤中细菌数量有密切的关系,脱氢酶活性可作为判断细菌群落结构是否发生变化的指标之一.其原因在于部分土壤微生物体内的脱氢酶通过催化生物氧化还原反应,而后经过氧化磷酸化作用生成腺苷三磷酸(ATP),以作为异养生物能量的主要来源,该类土壤细菌得以生存.
注:*、**分别代表差异达到极显著(<0.01)、显著(<0.05)水平.
3 讨论
根据Shannon指数和Chao指数,将复垦样本数据除以对照样本计算贴近度,表征复垦地土壤相比正常农田土壤的生物多样性的贴近程度.在0~20cm土层,S、M、L样本的Shannon指数贴近度分别为66.61%、65.04%、33.06%,Chao指数的贴近度分别为54.88%、65.25%、14.69%,说明在0~20cm深度的土层,随着复垦年限增加,煤矸石充填复垦土壤的细菌群落多样性和物种丰富度会偏离正常农田的水平.在20~40cm土层,S、M、L样本的Shannon指数贴近度分别为60.74%、34.38%、86.59%,Chao指数的贴近度分别为44.87%、15.20%、87.57%,数值虽有波动,但是值得注意的是,复垦15年的20~40cm深度的样本中,细菌群落多样性和物种丰富度已经与正常农田的水平十分接近.
从不同分类水平上对土壤微生物优势菌进行分析,厚壁菌门、变形菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、肠球菌科、链球菌科、芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属-JH7、屎肠球菌、乳球菌属-piscium是研究区煤矸石充填复垦土壤中的优势菌(表2).这与陈来红等[16]对露天煤矿区复垦多样性的研究结果类似.而李媛媛等[24].对采煤塌陷区泥浆泵复垦的研究发现,土壤细菌主要由变形菌、放线菌、浮霉菌、酸杆菌、绿弯菌、拟杆菌、芽单胞菌、厚壁菌和硝化螺旋菌组成,且复垦的效果优于本研究区,这可能由于复垦方式和农田耕作方式的不同引起的差异,说明复垦方式对土壤细菌群落结构的影响显著,也说明土壤微生物对生态环境变化十分敏感.计算优势菌的贴近度,结果见表4:厚壁菌门以及厚壁菌门下属的芽孢杆菌纲、乳杆菌目、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、链球菌科、肠球菌科、芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属-JH7、屎肠球菌、乳球菌属- piscium等的贴近度基本呈现样本S
不同复垦年限土壤细菌的演替是有差异的,在不同复垦年限,土壤生态系统优势菌群的比例在不断发生变化.在0~20cm土层的复垦土壤中,厚壁菌门的相对丰度随着复垦年限增加而增加,在复垦15年的样本中厚壁菌门占绝对优势,相对丰度高达93.83%.厚壁菌门中主要的细菌目、细菌科、细菌属在复垦土壤中的数量比例会大于正常农田土壤,说明厚壁菌门有特殊的生理结构,多数菌种能通过形成孢子适应矿区缺水和极端环境,因此对于采煤塌陷地的生态修复、土壤生态系统的重建有重要意义.芽孢杆菌属具有耐高热、低温、辐射等抵抗极端环境的能力,并去除土壤中的重金属污染,是一种环境友好型生物农药[32].类芽孢杆菌的菌株具有抗性强、固氮、抑菌等优良特性,可以作为促生菌剂促进植物生长[33].芽孢杆菌属-JH7具有耐碱耐热性[34],屎肠球菌长速快,有较好的黏附能力,能产生乳酸及一些抗菌物质[35],可用作益生菌制剂.因此上述几种菌能与经过复垦工程后发生改变的生态系统相适应,能改良土壤环境,改善养分相对贫瘠的复垦土壤,表现出复垦后土壤质量提升的目的.贺龙等[14]也有同样的研究结果,其研究认为,露天煤矿复垦土壤的优势菌群多为化能自养或化能异养型细菌或参与氮循环、或降解多环芳烃类有机物等有利于污染土壤的生态修复和土壤肥力恢复的功能细菌属,能在营养贫瘠的环境下生长繁殖,这对于复垦土壤肥力恢复具有重要作用,尤其是对露天煤矿的土壤修复、生态系统改善具有重要的利用价值.变形菌门以及变形菌门下的-变形菌纲、-变形菌纲、-变形菌纲、除硫单胞菌目的数量变化和厚壁菌门相反,在0~20cm土层中随着年限增加而减少,在20~ 40cm土层中随着年限增加而增加,因此有向下层土壤转移分布的趋势.变形菌门是革兰氏阴性菌,是细菌中数量最多、可培养细菌最多、代谢多样性最高的门.变形菌门在维持土壤生态系统功能中扮演着重要的角色,为整个系统的氮素以及能量的循环提供帮助,对农业有重要意义的菌种,可以有效提高土壤的质量.放线菌门菌群能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂,对有机物的矿化有着重要作用.在土壤中增加放线菌,有利于土壤中有机质的增加,提高土壤养分,改良土壤,促进植被生长.而本研究复垦土壤中的含量低于正常水平,说明煤矸石充填复垦土壤的修复能力低于正常农田土壤,在今后的土地复垦中可适量培育放线菌门,以增加土壤的自身修复能力,以达到改善土壤质量的目的.通过对比复垦地和对照地的细菌群落特征,0~20cm土层中的细菌群落结构比20~40cm土层中的细菌群落更容易受人为扰动或时间推演而发生变化,同时,发现土壤生态系统不稳定的复垦地中缺少某些有益菌,通过增施生物有机肥或特定的微生物肥,调节土壤环境微生态,使土壤中有机质和有益细菌数量增加,加速土壤细菌群落演替的速度和土壤生态系统的稳定,这对于指导土壤复垦具有重要的理论指导意义.
表4 土壤样本优势菌序列数的贴近度(%)
土壤酶活性与微生物数量之间有密切的关系,采煤塌陷与复垦工程改变了脱氢酶活性的垂直分布特征,土壤脱氢酶含量在垂直分布上总体呈现出随土层深度的增加而递减的规律.这与相关文献的研究结果相一致,李智兰等[31]认为这是土壤酶活性的表聚性.这可能是因为0~20cm土层中植物根系发达,植物残体以及土壤微生物数量较多,使得土壤养分含量高,脱氢酶作用的底物多.脱氢酶活性随复垦年限变化呈现不同的分布特征,且与土壤细菌群落的主要菌种有显著相关关系.脱氢酶活性与厚壁菌门下的多种细菌的数量呈显著负相关,与放线菌门的数量呈显著正相关,与-变形菌纲的数量呈极显著正相关.可能是因为复垦土壤与正常农田土壤有不同的养分结构,致使土壤细菌群落有不同的响应,生物体内的酶活性随之发生变化.酶活性越强,生物化学反应越强烈,则生化反应产物越多,对于体内含有较多脱氢酶的细菌来说,其数量越多;体内含有较多脱氢酶的细菌的数量越多,则土壤中脱氢酶的活性越高,因此这种细菌的数量与脱氢酶活性是相互促进发展的协同关系,能共同反映土壤细菌群落的结构及变化趋势,故可作为评价复垦土壤肥力的指标,为改良复垦土壤质量提供理论依据[36-37].诸如孟会生等[8]研究认为,复垦土壤主要的变形菌门与Olsen-P、碱性磷酸酶有很高的相关性,将细菌群与酶活性建立联系,细菌可作为土壤磷有效性的灵敏性指标.土壤微生物和土壤环境是相互作用相互影响,揭示土壤微生物群落和土壤理化性质的关系,建立土壤质量和土壤微生物的监测指标,更有助于提高矿区土壤质量.
4 结论
4.1 与未受采煤塌陷影响的正常农田土壤相比,复垦土壤在各个分类水平的细菌种类数量减少,群落多样性降低,脱氢酶活性降低.复垦土壤和对照土壤的优势菌群种类一致,但是优势菌群的序列随着复垦年限不同发生变化.
4.2 厚壁菌门、变形菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、肠球菌科、链球菌科、芽孢杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属-JH7、屎肠球菌、乳球菌属-piscium是研究区煤矸石充填复垦土壤中的优势菌.
4.3 采煤塌陷改变了脱氢酶活性的垂直分布特征,并且随复垦年限变化呈现不同的分布特征.土壤中脱氢酶活性可以间接反应某种细菌的数量特征,脱氢酶活性与厚壁菌门下的多种细菌的数量呈显著负相关,与放线菌门的数量呈显著正相关,与-变形菌纲的数量呈极显著正相关.
4.4 复垦过程中,细菌作为生态演替过程中的先锋种群,对于复垦土壤质量恢复具有重要作用.例如厚壁菌门、芽孢杆菌、类芽孢杆菌、Bacillus sp. JH7等是有益于改良土壤环境的功能菌,能抵抗恶劣生存环境的有益菌,因而在复垦土壤中占有较大的数量优势,可以采用增加微生物菌的数量来改善养分贫瘠的复垦土壤.
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致谢：感谢上海BIOZERON有限公司在土壤样品基因测序和分析方面的帮助,感谢蔡延江副教授对本论文英文润色的帮助.
Variation of bacterial community structure and enzyme activities in reclaimed soil filled with coal gangues along a relamation chronosequence.
HOU Hu-ping, WANG Chen, LI Jin-rong, DING Zhong-yi, ZHANG Shao-liang*, HUANG Lei, DONG Jian, MA Jing, YANG Yong-jun
(School of Environment Science & Spatial Informatics, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221116, China)., 2017,37(11)：4230~4240
In this study, soil samples from the reclaimed land filled with coal gangue (SS) with different reclamation years (2015, 2010, and 2001 years) in Xuzhou mining area and from normal farmlands which were not affected by coal mining subsidence (SSC) were collected. The sequence numbers of bacterial community were determined by the Illumina PE250sequencing method, and the vertical structure and time structure were analyzed. The results showed that: (1) Reclamation decreased the number of bacteria species and the community diversity, but the goodness between SS and SSC increased with the age of reclamation. (2)anddominated in SS at the phylum level, the number ofincreased after reclamation andalso likely transferred from 20~40cm to 0~20cm soil layer. (3)predominantly existed in soils at the class level, the number ofin 0~20cm soil layer was higher in SS than in SSC samples, and the number in 20~40cm soil layers of SS samples decreased with the increase of the reclamation years. (4)anddominated in SS at the order level.played an important role in the remediation of heavy metal pollution and its number in 0~20cm soil layer of SS was 74.81~99.59% less than that in SSC samples. (5) In SS samples,,andwere the dominant family, while,andwere the dominant genus, andJH7,andwere the dominant species. All of these in SS samples were less in number than SSC samples especially in 0~20cm soil layer, while the number in 20~40cm soil layer of SS decreased with the increase of the reclamation years. (6)activity was negatively correlated with the number of, but was positively correlated with the number ofand the number of.Also, the type of dominant soil bacteria did not change, but their quantitative structure varied over time. Owing toare suitable for growth in the absence of water and extreme environments, butis conducive to soil nitrogen and energy cycling. Therefore, the soil quality was improved by adjusting soil bacterial community structure and shorten the recovery period.
land reclamation filled with coal gangue；soil microbial community；bacterial community structure；reclamation term；Xuzhou coal-mining areas
X171
A
1000-6923(2017)11-4230-11
侯湖平(1975-),女,山西孝义人,副教授,博士,主要从事煤矿区土地生态修复研究.发表论文80余篇.
2017-04-14
国家自然基金资助项目(51474217);中国矿业大学大学生创新训练项目(201610290044)
* 责任作者, 教授, slzhang@cumt.edu.cn
