基于双重猝灭原理的分子信标定量检测凝血酶

翟琨+李奉权+史伯安+向东山

摘 要 利用G碱基和有机猝灭基团对荧光基团的双重猝灭作用构建了分子信标，建立了一种基于双重猝灭原理的检测凝血酶的简单方法。此分子信标中荧光基团设计为羧基荧光素（FAM），有机猝灭基团设计为Black Hole Quencher 1 （BHQ1），BHQ1连接3个含有G碱基的核苷酸，分子信标的环设计为凝血酶的核酸适配体。体系中没有凝血酶时，分子信标呈茎环结构，荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ1及G碱基相互靠近，FAM的荧光在BHQ1及G碱基的双重猝灭下，其荧光信号很弱； 当体系中有凝血酶存在时，分子信标与凝血酶特异性结合，形成G四联体结构，茎环结构被破坏，FAM远离猝灭基团BHQ1及G碱基，其荧光得到恢复。在最适条件下，体系的荧光强度（ΔI）与凝血酶的浓度（C）在0.4～40 nmol/L范围内具有良好的线性关系，线性回归方程为ΔI=24.63C （nmol/L）+13.06 （R2=0.9972），检出限为0.18 nmol/L （3σ， n=9）。实际血样加标回收率为96.3%～98.7%。

1 引 言

凝血酶（Thrombin，TB）是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白酶，在人体凝血过程中发挥了重要作用[1，2]。适配体是通过指数富集的配体系统进化技术，经体外筛选得到的能与蛋白质或小分子的特定区域相结合的寡聚核苷酸片段（DNA或RNA），可以特异性地识别相应的靶分子[3～8]。迄今，已筛选到的凝血酶核酸适配体序列有两个，一个是由 15个碱基构成的能识别凝血酶的肝素结合位点的适配体，另一个是由29个碱基构成的能识别凝血酶血纤维蛋白结合位点的适配体[9，10]。目前，这两种凝血酶核酸适配体都已被广泛用于凝血酶的检测[11～14]。

分子信标是一种可形成发夹结构的茎环双标记的寡核苷酸探针，具有选择性好、检测速度快以及无需与未反应的探针分离即可实时检测等特点，广泛应用于核酸检测分析[15～17]。目前分子信标在凝血酶的检测中已有应用，但使用的多为传统的分子信标，荧光背景较高，影响了定量分析的灵敏度[18，19]。

本研究基于鸟嘌呤（G碱基）对FAM具有较好的猝灭作用[20，21]的原理，利用G碱基和有机猝灭基团对FAM的双重猝灭作用，设计了一种结构简单、合成容易的具有双重猝灭作用的分子信标，稳定性好， 荧光背景信号低， 与凝血酶反应速度快，基于此建立了快速定量检测凝血酶的新方法。

2 实验部分

2.1 仪器与及试剂

RF5301PC荧光光谱仪（日本Shimadzu公司）； 凝血酶（上海麦克林生化科技有限公司（中国））； 牛血清蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、牛血红蛋白（HB），购于上海邦景实业有限公司； 其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司； 实验所用缓冲溶液为0.1 mol/L TrisHCl 緩冲溶液； 所有的分子信标均由上海生工生物技术有限公司（中国）合成，其序列如表1所示。

2.2 样品制备及检测

将分子信标及凝血酶分别用0.1 mol/L TrisHCl （pH 8.0）缓冲溶液配制成400 nmol/L储备液，并分别稀释成不同浓度的溶液，备用。取50 μL凝血酶溶液加入到50 μL的分子信标溶液中，混合均匀，补加TrisHCl缓冲溶液至500 μL，室温下反应30 min，检测荧光信号。本研究采用同步荧光分析法，因为FAM的最大激发波长与最大发射波长之差（斯托克斯位移）为26 nm，因此实验中同步扫描的波长间隔（Δλ）设置为26 nm，荧光分光光度计的激发及发射狭缝宽度均设置为10 nm。

2.3 选择性实验

在4份50 μL 400 nmol/L凝血酶溶液中，分别加入50 μL蒸馏水、50 μL 浓度为4×10

Symbolm@@ 4 mol/L的牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、牛血红蛋白（HB）溶液，再分别加入50 μL 400 nmol/L分子信标溶液，最后加入TrisHCl缓冲溶液至500 μL，混合均匀，常温下反应30 min后，进行荧光检测。

3 结果与讨论

3.1 检测原理

利用双重猝灭分子信标检测凝血酶的原理如图1所示。体系中没有凝血酶存在时，分子信标呈茎环结构，荧光基团FAM与猝灭基团BHQ1及G碱基相互靠近，FAM的荧光在BHQ1及G的双重猝灭下，其荧光信号很弱； 体系中存在凝血酶时，分子信标的环即凝血酶的适配子序列与凝血酶特异性结合形成G四联体结构，茎环结构被破坏，FAM荧光基团远离猝灭基团BHQ1及G碱基，荧光得到恢复。凝血酶浓度越高，与其结合的分子信标越多，即更多的环被打开，因此体系的荧光信号越强，通过FAM荧光信号增强的程度可实现对凝血酶的定量检测。

3.2 双重猝灭分子信标的构建

本研究中，凝血酶的检测是基于有机猝灭基团和G碱基对荧光基团的双重猝灭作用。选择能被G碱基猝灭的有机染料FAM 作为分子信标的荧光基团， BHQ1作为分子信标的猝灭基团，因为BHQ1的最大吸收波长为535 nm，FAM的最大发射波长为525 nm，因此在BHQ1与FAM相互靠近时，FAM的荧光能被BHQ1很好地猝灭。另外，与BHQ1相连接的G碱基数目越多，猝灭的效果越好[22]。本研究设计了G碱基数目分别为3个、2个、1个及没有G碱基的4种分子信标（即MB1、MB2、MB3、MB4），并与没有猝灭基团的分子信标（MB6）的猝灭效果进行比较（图2）。结果表明，随着G碱基数目的增加，分子信标的背景荧光逐渐降低，但降低的程度逐渐减小。这主要是因为增加的G碱基与荧光基团的距离逐渐增加的缘故。因此，选择MB1对凝血酶进行检测。

图2 分子信标茎的不同G碱基数目对猝灭效果的影响（a→e： MB1，MB2，MB3，MB4，MB6），各分子信标的浓度均为32 nmol/Lendprint

Fig.2 Effect of the number of G base in the stem of MB on quenching effect （a→e： MB1， MB2， MB3， MB4， MB6）. Concentration of each MBs is 32 nmol/L， respectively

3.3 双重猝灭分子信标性能评价

对不同猝灭基团猝灭FAM的效果进行考察（图3）。结果表明，当分子信标中既没有G碱基也没有猝灭基团（MB6）时，体系具有较强的荧光信号（图3d）； 当分子信标中只有有机猝灭基团（MB4）或只有G碱基（MB5）时，分子信标的荧光信号显著减弱（图3b， 3c），说明有机猝灭基团BHQ1和G碱基对FAM都具有很好的猝灭作用； 当分子信标中既有G碱基， 又有有机猝基团BHQ1（MB1）时，分子信标的荧光信号变得非常微弱（图3a），说明G碱基和有机猝基团BHQ1对FAM的双重猝灭效果更好。根据计算，经典分子信标（MB4）的猝灭效率为90.3%，信背比（没有猝灭基团的分子信标所产生的信号与有猝灭基团的分子信标所产生的信号之比）为10.3； 双重猝灭分子信标的猝灭效率为97.5%，信背比为39.8。因此，基于双重猝灭的分子信标的荧光背景远低于经典分子信标。

3.4 工作曲线及检出限

考察了凝血酶的浓度与相应的体系荧光强度之间的关系，图4为不同浓度的凝血酶所对应的同步荧光光谱图。在0.4～ 40.0 nmol/L范围内，体系的荧光强度（ΔI）与凝血酶的浓度（C）具有良好的线性关系（图4插图），线性回归方程为ΔI= 24.63 C （nmo/L）+13.06 （R2=0.9972），检出限为0.18 nmol/L（3σ， n=9）。对3.0 nmol/L凝血酶重复测定9次，响应值的相对标准偏差（RSD）为 3.7%，说明此方法精密度良好。

3.5 选择性

对建立的检测方法的特異性进行了考察（图5）。结果表明， 40 nmol/L凝血酶溶液中加入40.0 μmol/L的BSA、OVA及HB后，各体系的荧光强度几乎无变化，说明这几种干扰蛋白的存在对凝血酶的检测没有明显影响，表明此分析方法具有良好的选择性。

与文献报道的利用适配体或荧光方法检测凝血酶方法相比（表2），本方法检出限更低。

3.6 血清样品的加标回收实验

取人血清样品，离心后稀释500倍； 取2份稀释后的血清样品，分别加入不同浓度水平的凝血酶，利用本方法进行检测（表3）。两个加标水平的回收率为96.3%和98.7%，说明本方法具有较高的准确性。

4 结 论

利用G碱基和有机猝灭基团对荧光基团的双猝灭作用构建了一种结构简单的基于双重猝灭原理的分子信标，并建立了一种检测凝血酶的简单方法，获得了更低的检出限（0.18 nmol/L）。endprint