水飞蓟宾对豚鼠皮肤色素沉着影响的实验研究

徐艳明++++++杨柳++++++付巍+++++++李建民++++++王雪

[摘要]目的 探讨水飞蓟宾对中波紫外线（UVB）诱导的色素沉着豚鼠模型的影响。方法 采用紫外线光疗仪照射棕黄色豚鼠，建立豚鼠皮肤色素沉着模型，将豚鼠分为空白对照组、模型组、基质组、治疗组、阳性对照组，每组8只共40只。其中模型组、治疗组和阳性对照组分别给与UVB照射15 min，连续照射20 d，分别给基质组、治疗组、阳性对照组基质、水飞蓟宾和玉兰油30 d后，对豚鼠皮肤组织中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸相关蛋白酶-2（TRP-2）的含量进行检测。结果 与模型组比较，治疗组豚鼠皮肤色素明显变浅，组织匀浆液中SOD、CAT活力明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），TYR、TRP-2含量明显降低（P<0.05）。结论 水飞蓟宾具有抑制色素沉着的作用，作用机制可能与其能够清除自由基防止组织过氧化损伤，抑制酪氨酸酶分泌有关。

[关键词]色素沉着；中波紫外线；水飞蓟宾

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）10（b）-0007-04

[Abstract]Objective To explore the influence of Silybin on guinea pigs model induced pigmentation by UVB.Methods Brown yellow guinea pigs were irradiated by ultraviolet ray phototherapy apparatus，the skin pigmentation of guinea pigs model was established，the guinea pigs were divided into blank control group，model group，matrix group，treatment group，and positive control group，there were 40 guinea pigs，each group 8 guinea pigs.Model group，treatment group and positive control group were irradiated by 1 min for 20 days continually，matrix group，treatment group and positive control group were used matrix，silybin and Olay for 30 days，the SOD，CAT，TYR and TRP-2 content in guinea pigs were tested.Results Compared with model group，guinea pigs′skin pigment becomes shadow distinctively，SOD，CAT activity in tissue homogenizing fluid becomes high distinctively，the differences were statistically significant （P<0.05），TYR，TRP-2 contents decrease distinctively（P<0.05）.Conclusion Slybin can inhibit skin pigmentation，the mechanism function may be related to the ability of removal free radicals from oxidative damage and inhabitation of tyrosine′s activity

[Key words]Pigmentation；UVB；Silybin

色素沉著性疾病是由于大量黑色素非正常聚集于皮肤的不同部位形成，常见疾病如黄褐斑、炎症后色素沉着、黑变病等，严重者损美给患者带来极大心理负担，影响生活质量。目前市场上治疗色素沉着的方法层出不穷，但缺乏有效率高、不良反应小、复发率低的治疗方法。研究发现[1]水飞蓟宾在整体、组织和细胞形态、氧化损伤和ROS水平、MAPK/NF-κB信号通路的激活以及自噬的调节等方面对UVB引起的损伤均发挥了明显的对抗作用。本研究选择水飞蓟宾应用于UVB诱导的皮肤色素沉着动物模型，综合评价水飞蓟宾对色素沉着的治疗作用并探讨其可能作用机制，为祛斑美白功效型化妆品的研发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1动物 普通级健康棕黄色豚鼠40只，6周龄，体质量240～260 g，由长春市亿斯试验动物技术责任有限公司提供（合格证号：SCXK-（吉）2014-0002）。

1.1.2药物 水飞蓟宾乳霜（自制，批号：20150601）；薇婷脱毛膏（深圳市先灵葆雅生物科技有限公司，批号：20141107）；玉兰油新生塑颜金纯面霜（广东宝来实业有限公司，批号：20151115）；豚鼠酪氨酸酶（TYR）、豚鼠酪氨酸相关蛋白酶-2（TRP-2）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20151115）；WST-1法超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150921）；考马斯亮蓝法蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：20151021）。

1.1.3仪器 紫外光疗仪（Sigma公司），紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂），TL-2010S中通量组织匀浆机（北京鼎昊源科技有限公司），YB1201DW型电子天平（上海海康电子仪器厂），8-5K离心机（上海安亭科学仪器厂），Rsearch UV UF型超纯水制备系统（上海和泰仪器有限公司），半自动生化分析仪（四川美生科技有限公司），酶标仪（上海热电仪器有限公司）。endprint

1.2方法

1.2.1药物的制备 水飞蓟宾乳霜的制备：将16醇和十六烷基糖苷、单硬脂酸甘油酯、橄榄油、角鲨烷、十六-十八醇混合后升温至80℃溶解制得油相；将甘油加入去离子水中，升温至80℃，加入对羟基苯甲酸甲酯，搅拌至全部溶解，制得水相；然后，将水相加入油相中，均质8 min，搅拌降温至40℃，加入用丙二醇分散的水飞蓟宾，搅拌至分散均匀，制成含1.0%杜仲提取物的乳霜。空白基质乳霜的制备：将16醇和十六烷基糖苷、单硬脂酸甘油酯、橄榄油、角鲨烷、十六-十八醇混合后升温至80℃溶解制得油相；将甘油加入去离子水中，升温至80℃，加入对羟基苯甲酸甲酯，搅拌至全部溶解，制得水相；然后，将水相加入油相中，均质8 min，搅拌降温至40℃，加入与水飞蓟宾乳霜等量的丙二醇，搅拌至分散均匀即得空白基质乳霜。

1.2.2豚鼠色素沉着模型建立 使用SS-04B型紫外线光疗仪。照光前电动剃毛刀将豚鼠背部棕黄色长毛剃除，再以女用脱毛膏脱去短毛以充分裸露背部皮肤。将豚鼠置于紫外光疗仪灯具下照射，照射距离40 cm。每天照射15 min，出现水疱、红肿等，光照暂停至症状缓解，照射20 d，达到累计照射剂量UVB为1.8 mJ/cm2，豚鼠背部皮肤形成稳定而均匀的色素沉着造模完成[2-3]。紫外线的照射劑量按公式1[4]计算，照射强度通过紫外线辐照计测量来测定。

照射剂量（J/cm2）=照射强度（W/cm2）×照射时间（s）。

1.2.3测量方法 应用FeSO4染色法，观察水飞蓟宾对黑素细胞的影响，采用抗氧化试剂盒及ELISA试剂盒检测水飞蓟宾的抗氧化活性及其抑制酪氨酸酶的活力。

1.2.4动物分组和给药 豚鼠40只，随机分为5组，每组8只，分为空白对照组、基质组、治疗组、阳性对照组。空白组：正常饲养；基质组：造模2周后每天涂乳霜基质0.1 g；治疗组：造模2周后按每天涂水飞蓟宾乳霜0.1 g；阳性对照组：造模2周后每日外涂玉兰油0.1 g。

1.2.5取材 第31天，处死豚鼠，剃毛，常规手术取下实验暴露部位皮肤，一部分浸入10%福尔马林中固定，做好标记并制成病理切片。另一部分皮肤组织制成10%组织匀浆液待测。

1.3指标观测

1.3.1组织病理观察 豚鼠皮肤常规石蜡切片，FeSO4染色，显微镜下观察黑色素含量的变化。

1.3.2动物组织样本的前处理 取皮肤组织块（0.1～0.2 g）最少可到2～5 mg在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入5 ml的匀浆管中。按重量（g）：体积（ml）=1∶9的比例加入9倍体积PBS于匀浆管中，冰水浴条件下用眼科小剪剪碎组织块。用中通量组织匀浆机匀浆，匀浆时间10 s/次，间隙30 s，连续10次，在冰水中进行，离心20 min左右（2000～3000 r/min）。仔细收集上清，即得10%组织匀浆。

1.3.3实验豚鼠皮肤组织超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力测定 考马斯亮蓝法蛋白定量测试盒测定总蛋白含量。按SOD、CAT测定试剂盒说明检测。

1.3.4实验豚鼠皮肤组织酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸相关蛋白酶-2（TRP-2）含量测定 按TYR、TRP-2 ELISA试剂盒说明进行检测。

1.4统计学方法

使用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，各组间采用t检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1皮肤颜色变化

经高能紫外线（总量2500 mJ/cm2）照射豚鼠背部皮肤，1～2 d后照射部位出现红斑，4～5 d肉眼所见红斑消退，6～7 d后开始出现色素沉着，10 d左右色素沉着稳定，开始用药。用药30 d后，基质组豚鼠皮肤脱屑、发红、色素沉着严重。给药组、对照组色素明显变淡，发红、脱屑较轻。

2.2组织病理学观察

空白组豚鼠表皮基底层几乎看不到黑素颗粒；模型组豚鼠表皮基底层可见大量黑素颗呈粒带状分布，棘层黑素颗粒帽状分布；基质组豚鼠表皮基底层可见较多黑素颗粒；给药组豚鼠表皮基底层黑素颗粒明显减少；对照组豚鼠表皮基底层黑素颗粒显著减少（图1）。

2.3各组实验动物皮肤组织中SOD、CAT活力

与空白相比，模型组豚鼠皮肤组织中SOD、CAT活力显著降低（P<0.01），说明模型建立成功；与模型组比较，基质组豚鼠皮肤中SOD、CAT活力无明显变化；治疗组豚鼠皮肤组织中SOD、CAT活力明显升高（P<0.05）；对照组豚鼠皮肤组织中SOD、CAT活力明显升高（P<0.05）。结果提示，水飞蓟宾能够清除自由基防止组织过氧化损伤（表1）。

2.4各组实验动物皮肤组织中TYR、TRP-2分泌含量

与空白组比较，模型组豚鼠皮肤组织中TYR、TRP-2含量显著升高（P<0.01），说明模型建立成功；与模型组比较，基质组豚鼠皮肤中TYR、TRP-2含量无明显变化；治疗组豚鼠皮肤组织中TYR、TRP-2含量明显升高（P<0.05）；对照组豚鼠皮肤组织中TYR、TRP-2含量显著升高（P<0.01）。结果提示，水飞蓟宾能够抑制酪氨酸酶及酪氨酸相关蛋白酶的分泌（表2）。

3讨论

现研究表明色素沉着性疾病与日晒密切相关，紫外线作为一种外源性刺激，能使维生素D原转化成维生素D3，使色斑发病的主要物质-酪氨酸的含量增加，从而调节和诱导黑色素的合成[5-6]。UVB作为紫外线的一种，波长280～320 nm，是紫外线生物学效应最活跃部分，红斑反应作用强。因此，本实验采用UVB诱导豚鼠皮肤色素沉着建立模型，色素沉着均匀、稳定。

黑素的合成主要由酪氨酸酶来调控，可以通过抑制此酶的活性，来减少黑素的合成，从而达到美白的效果[7-9]。本实验采用ELISA法测定豚鼠皮肤组织中TYR、TRP-2含量[10-12]，结果提示水飞蓟宾能够明显抑制UVB诱导的豚鼠色素沉着皮肤中TYR、TRP-2的分泌。推测水飞蓟宾可以和L-多巴竞争结合酪氨酸受体位点，从而抑制黑素生成。endprint

研究证实，氧自由基与色素沉着有关[13]。人体内氧自由基的形成与消除在基因调控的保护机制作用下始终处于动态平衡状态，CAT、SOD等氧自由基清除剂不能随脂质过氧化（LPO）增多而增强清除能力，导致LPO的蓄积，LPO可作为启动因素使酪氨酸酶系列氧化反应加速，致黑素细胞产生黑素颗粒增多。本实验采用抗氧化试剂盒检测豚鼠皮肤组织中CAT、SOD活力[14-15]。结果提示，水飞蓟宾能够显著增强CAT、SOD活力。推测水飞蓟宾可以通过抑制自由基生产降低酪氨酸酶活性抑制黑色素生成。

综上所述，水飞蓟宾具有抑制色素沉着的作用，作用机制可能与其能够清除自由基防止组织过氧化损伤，抑制酪氨酸酶分泌等有关。

[参考文献]

[1]王琼.水飞蓟宾对中波紫外线（UVB）诱导小鼠皮肤炎症保护作用及机制研究[D].沈阳：沈阳药科大学，2009.

[2]路建伟，路风琴.白癜风动物模型研究进展与思考[J].湖南中医杂志，2014，30（4）：188-190.

[3]Barakat M，Fawzy A.Skin pigmentation after NB-UVB and three analogues of prostaglandin F（2alpha） in guinea pigs：a comparative study[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2010， 24（1）：28-31.

[4]张宁，陈巧云，徐艳明，等.杜仲对紫外线诱导的人皮肤角质形成细胞光老化模型的影响[J].中医药信息，2010，27（1）：31-33.

[5]Yusnizar Y，Wilbe M，Herlino AO，et al.Andersson.Microphthalmia-associated transcription factor mutations are associated with white-spotted coat color in swamp buffalo[J].Anim Genet，2015，46（6）：676-682.

[6]Park HJ.Induces anagen phase of telogenic hair follicles through regulation of β-Catenin，stimulation of dermal papilla cell proliferation，and melanogenesis[J].J Diet Suppl，2014， 11（4）：320-333.

[7]Yun CY，You ST，Chung JH，et al.p21-activated kinase 4 critically regulates melanogenesis via activation of the CREB/MITF and β-Catenin/MITF pathways[J].J Invest Dermatol，2015，135 （5）：1385-1394.

[8]Yang S，Zhang J，Ji K，et al.Characterization and expression of soluble guanylate cyclase in skins and melanocytes of sheep[J].Acta Histochemica，2016，118（3）：219-224.

[9]Wei F，Li M，Cheng SY，et al.Cloning，expression，and functional characterization of the rat Pax6 5a orthologous splicing variant[J].Gene，2014，547（1）：169-174.

[10]趙晖，谭金凤，刘宁.色素障碍性皮肤病色斑面积的简易测量方法[J].中国皮肤病与性病杂志，2014，28（4）：424-426.

[11]Liu H，Sui X，Li X，et al.Lyoniresinol inhibits melanogenic activity through the induction of microphthalmia-associated transcription factor and extracellular receptor kinase activation[J].Mol Cell Biochem，2013，373（1-2）：211-216.

[12]Krishna M，Narang H.The complexity of mitogen-activated protein kinases （MAPKs） made simple[J].Cell Mol Life Sci，2008，65（22）：3525-3544.

[13]Cui Y，Huang C，Liu P，et al.Effects of moxa （artemisia vulgaris） smoke inhalation on heart rate and its variability[J].Chin Med，.2011，24 （2）：53-57.

[14]张理梅，马玲，应为红，等.祛斑方对紫外线照射后色素沉着动物模型病理形态学影响[J].中华中医药杂志，2014， 10（2）：3291-3294.

[15]Vachiramon V，Sahawatwong S，Sirithanabadeekul P.Treatment of melasma in men with low-fluwnce Q-switched neodymium-Doped yttrium-aluminum-garnt laser versus combined laser and glycolic acid peeling[J].Dermatol Surg，2015，41（4）：457-465.endprint