镉逆境胁迫下甜菜谷胱甘肽合成酶（BvGS）基因的克隆

刘大丽 ，马龙彪 *，郭爱英 ，杨洪 ，鲁振强

（1.黑龙江省高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点实验室/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；3.黑龙江省高等学校生化与分子生物学重点实验室/黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080）

镉逆境胁迫下甜菜谷胱甘肽合成酶（BvGS）基因的克隆

刘大丽1，2，马龙彪1，2*，郭爱英1，2，杨洪1，2，鲁振强3

（1.黑龙江省高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点实验室/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；3.黑龙江省高等学校生化与分子生物学重点实验室/黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080）

利用RT-PCR技术，克隆了甜菜谷胱甘肽合成酶基因（BvGS；LOC104891052），其CDS全长为1 662 bp，编码553个氨基酸。以Beta vulgaris Actin 1为内参基因，半定量RT-PCR的研究结果表明：与 0 mM CdCl2的对照处理相比，在 0.5、1.0、1.5、2.0 mM CdCl2的逆境胁迫下，甜菜 BvGS基因的表达量随着处理浓度的增加而逐渐增大。这说明BvGS基因在其转录表达水平上受到了镉胁迫的诱导，并与镉逆境存在着一定的应答关系。

甜菜；基因；克隆；谷胱甘肽合成酶；镉逆境

在生物体内的重金属耐受性作用机制及调控规律中，重金属逆境响应蛋白在植物抵御重金属离子毒害方面发挥着重要的作用。在生物细胞内存在着很多游离的、低分子量的巯基。这些巯基主要构成成分是谷胱甘肽（Glutathione，GSH）。GSH是一种具有重要生理功能的活性三肽，它可以作为抗氧化剂，维持细胞氧化还原状态[1]；其次，它可以与分子发生亲电结合反应从而使进入细胞的外源异生物脱毒[2]；再次，GSH还可以和重金属离子络合使这些离子更加容易被转运到液泡内以降低对细胞膜的损伤；最后，在植物体内，GSH还是合成植物螯合素PC的底物以结合更多的重金属离子[1-3]。

因此，如何提高生物体内GSH含量成为利用甜菜进行重金属污染生物修复的关键。谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GS，EC6.3.2.3）在这其中发挥着重要的作用。在真核细胞中，GSH在细胞内合成是由两步依赖于ATP的反应催化，分别是第一步由谷氨酸（L-glutamate）、半胱氨酸（L-cysteine）在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 （γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS，EC6.3.2.2） 催化下合成 γ-谷氨酰半胱氨酸 （γglutamylcysteine，γ-EC）；第二步在谷胱甘肽合成酶作用下，γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-Glutamyl cysteine）和甘氨酸（Glycine）合成谷胱甘肽。GS在这其中发挥着至关重要的作用[4-5]。

目前，国内外还没有关于甜菜谷胱甘肽合成酶基因（Beta vulgaris Glutathione Synthetase,BvGS）在重金属耐受性方面的相关研究报道，本研究从该基因的同源序列基因库筛选入手，在甜菜体内克隆这个重要的与重金属的耐受性和抗性相关的功能基因，研究其在镉（Cd）逆境下的转录表达规律，从而为揭示甜菜在重金属污染环境下的耐受性分子机制和重金属离子解毒机制打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

甜菜94004-2，由国家甜菜种质资源中期库（国家甜菜种质资源平台）提供。RT-PCR quick Master Mix（TOYOBO）；T4 ligase（Biolabs）；Trans5α 感受态细胞（TransGen）；Taq DNA polymerase（TransGen）；限制性内切酶（MBI）；pMD 18-T（TaKaRa）；未特殊注明试剂均为进口分析纯。

1.2 逆境胁迫处理及甜菜总RNA的提取

将两周大小的甜菜幼苗，分别置于含有0、0.5、1.0、1.5、2.0 mM CdCl2的Hogland营养液中，48 h后，分别剪取不同重金属逆境处理的甜菜幼苗，用液氮速冻，并贮存于-70℃备用。

称取1 g植物幼嫩叶片组织，利用Trizol（Invitrogen）法提取甜菜总RNA。利用紫外分光光度计，分别在OD260和OD280条件下测定RNA的含量和纯度，并将样品的浓度稀释成1 μg/μL备用。取2 μg总RNA，经1.0%琼脂糖电泳，进一步确定RNA质量。

1.3 BvGS基因的克隆

利用RT-PCR quick Master Mix（TOYOBO）将甜菜RNA反转录为cDNA。根据甜菜谷胱甘肽合成酶Betavulgaris Glutathione Synthetase（BvGS，LOC104891052）基因的碱基序列，利用Sequencer设计引物[Forward primer （5’-3’）：ATG GGA TGT GGA TGC TCC ACT；Reverse primer （5’-3’）：TCA ACT TAG ATA TAA GCT GTC CAA G；Tm=55℃；扩增片段长度为1 162 bp]。以cDNA为模板PCR扩增获得BvGS基因cDNA的ORF全长。将pMD 18-T载体及回收的目的基因片段按照摩尔比1∶5进行连接，连接产物转化到Trans5α感受态细胞中。提取具有Amp抗性的大肠杆菌重组子的质粒DNA，利用KpnI对重组质粒进行限制性内切酶酶切鉴定。所获得的阳性克隆于上海生工进行测序，测序结果与Genbank中的序列进行比对以进一步确定克隆基因的正确性。

1.4 半定量RT-PCR分析

将定量后的甜菜cDNA反转录产物稀释20倍，取1 μL进行PCR扩增。其中，内参Beta vulgaris Actin 1基因 （BvActin 1，Genbank accession no.DQ866829） 的扩增引物分别为：Forward primer （5’-3’）：CCC ACT GAA TCC CAA GGC；Reverse primer （5’-3’）：TTT CCC GTT CGG CTG ATG；Tm=58℃；扩增片段长度为 399 bp[6]。取20 μL PCR产物，于1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，并利用GeneSnap进行检测。

2 结果与分析

2.1 重金属Cd逆境下BvGS基因的表达特性

谷胱甘肽合成酶 GS（Glutathione Synthetase）是 GSH（Glutathione）合成过程中的重要酶，它们的表达量与GSH含量有直接关系。为了研究甜菜Beta vulgaris Glutathione Synthetase（BvGS，LOC104891052）基因与重金属Cd逆境胁迫之间的应答关系，评价其在重金属耐受性方面的作用，实验分别用0、0.5、1.0、1.5、2.0 mM CdCl2重金属逆境处理两周大小的甜菜幼苗48 h。如图1A所示，随着重金属Cd逆境浓度的增加，甜菜幼苗的生长也受到了越来越严重的影响，在2.0 mM的CdCl2的作用下，甜菜的生长受到了严重的抑制。

提取甜菜总RNA，并以反转录的cDNA为模板，以 Beta vulgaris Actin 1基因（BvActin 1，Genbank accession no.DQ866829）为内参基因，进行Semi-quantitative RT-PCR比较分析。在未受到重金属胁迫的甜菜植株中，可以检测到少量BvGS基因的表达。在内参基因表达量基本一致的基础上，BvGS基因受到了Cd逆境胁迫的诱导，并且随着逆境胁迫强度的增加，其在转录水平上的表达量也逐渐增加（图1B）。这些结果说明甜菜BvGS基因受到了Cd逆境胁迫的诱导，并与其存在着一定的应答关系。

图 1 Cd2+逆境胁迫下，甜菜BvGS基因在转录水平上的表达特性Fig.1 Detection ofBvGStranscripts under Cd2+heavy metal stress

图2 甜菜BvGS基因的RT-PCR扩增Fig.2 RT-PCR of BvGS gene

图3 pMD 18-T-BvGS重组质粒鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid of pMD 18-T-BvGS

2.2 BvGS基因的克隆及序列分析

以甜菜幼嫩植株为材料提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，提取的RNA有两条清晰的28S和18S条带，其中，28S条带和18S条带完整明显，这表明RNA的质量良好（图2A）。以该RNA为模板进行反转录，获得cDNA第一链。利用RT-PCR技术，以cDNA第一链为模板，利用BvGS的CDS两端的特异引物进行PCR扩增，获得了长度为1.66 kb左右的基因片段（图2B）。

回收该基因片段，并将其连接到pMD 18-T载体上。提取大肠杆菌质粒DNA，利用限制性内切酶KpnI对重组质粒pMD 18-T-BvGS进行酶切（图3）。结果显示，通过酶切，分别在3.2 kb和1.18 kb的位置获得了两条片段，由于BvGS基因内部1 161 bp的位置上有一个KpnI酶切位点，并且在pMD 18-T载体的上游也有一个KpnI酶切位点，因此可以证明BvGS基因被顺式插入到pMD 18-T载体上。测序结果也进一步证实了所获得的阳性重组质粒的正确性。该基因CDS全长为1 662 bp，编码553个氨基酸。

3 讨论

从分子生物学的角度出发，挖掘和克隆甜菜体内重要的与重金属的耐受性和抗性相关的功能基因是揭示甜菜在重金属污染环境下的耐受分子机制的一个关键部分。甜菜基因工程在我国起步较晚，关于甜菜体内功能基因克隆的研究主要集中在改良甜菜的产量和含糖率方面[7]。本研究从重金属镉逆境胁迫出发，利用RT-PCR技术结合生物信息学数据库分析，在甜菜体内克隆获得了抗性功能基因BvGS的全长CDS序列。通过对正常条件下以及Cd逆境胁迫处理条件下，甜菜幼苗中该基因的差异表达情况的细致研究，发现该基因与重金属镉逆境存在着一定的应答关系。实验的结果为进一步研究甜菜在镉逆境下的分子调控机制及基因表达规律奠定了基础，同时也为甜菜生物技术研究以及植物育种专家提供了有价值的抗性功能基因资源。

[1]Millar A.H.,Mittova V.,Kiddle G.,et al.Control of ascorbate synthesis by respiration and its implications for stress responses[J].Plant Physiol.,2003,133（2）:443-447.

[2]Foyer C.H.,Noctor G.Redox homeostasis and antioxidant signaling:a metabolic interface between stress perception and physiological responses[J].Plant Cell.2005,17（7）:1866-1875.

[3]Rausch T.,Gromes R.,Liedschulte V.,et al.Novel insight into the regulation of GSH biosynthesis in higher plants[J].Plant Biol.,2007,9（5）:565-572.

[4]Zhu Y.L.,Pilon-Smits E.A.H.,Jouanin L.,Terry N.Overexpression of glutathione synthetase in Indian mustard enhances cadmium accumulation and tolerance[J].Plant Physiol.,1999a,119（1）:73-79.

[5]Zhu Y.L.,Pilon-Smits E.A.H.,Tarun A.S.,et al.Cadmium tolerance and accumulation in Indian mustard is enhanced by overexpressing gamma-glutamylcysteine synthetase[J].Plant Physiol.,1999b,121（4）:1169-1177.

[6]Liu D.,Mao Z.,An Z.,Lu Z.and Ma L.Enhanced heavy metal tolerance and accumulation by transgenic sugar beets expressing Streptococcus thermophilus StGCS-GS in the presence of Cd,Zn and Cu alone or in combination[J],PLOS ONE,2015,10（6）:1-6.

[7]刘大丽，马龙彪，郝慧.甜菜磷酸蔗糖合成酶的转基因研究[J]，中国糖料，2013，35（3）：13-14.

Cloning of Beta vulgaris Glutathione Synthetase （BvGS）Gene under Cadmium Stress

LIU Da-li1,2,MA Long-biao1,2*,GUO Ai-ying1,2,YANG Hong1,2,LU Zhen-qiang3
（1.Key Laboratory of Sugarbeet Genetics and Breeding/Crop Academy of Heilongjiang University,Harbin,150080,Heilongjiang;2.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Sugarbeet Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin,150080,Heilongjiang;3.Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology/College of Life Sciences,Heilongjiang University,Harbin 150080,Heilongjiang）

The gene of Beta vulgaris glutathione synthetase （BvGS,LOC104891052）was cloned using RT-PCR.The CDS length of BvGS was 1662 bp,encoding 553 amino acids.By using Beta vulgaris Actin 1 as a control,the results of semi-quantitative RT-PCR showed that the expression level of BvGS was enhanced when the concentration of CdCl2was increased from 0.5,1.0,1.5 to 2.0 mM,compared with the control seedlings without treatment （0 mM CdCl2）.These results exhibited that sugarbeet BvGS gene's transcript was induced by cadmium,and it was responsive to such hazardous heavy metal stress.

sugarbeet（Beta vulgaris）;gene;cloning;glutathione synthetase （GS）;cadmium stress

S566.3

A

1007－2624（2017）06－0023－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.06.006

2017-06-15

黑龙江省教育厅资助项目（12541641）。

刘大丽（1981-），女，博士，副研究员，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：daliliu2007@sina.com

马龙彪（1965-），男，副研究员，硕士生导师，主要从事甜菜生物技术研究。E-mail：caasmlb@163.com