黑青稞花色苷提取及抗氧化活性的分析

2017-11-18杜道坤贺娟孟利东康志钰

江苏农业科学 2017年18期

杜道坤+贺娟+孟利东+康志钰

摘要：为探讨黑青稞色素资源的开发与利用，以完整黑青稞种子为材料，在单因素试验基础上结合响应面分析法，以提取温度、液料比、乙醇浓度、pH值为因素，花色苷提取量为响应值优化黑青稞花色苷提取工艺，进而测定其还原能力，以及清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的能力。结果表明，黑青稞花色苷最佳提取工艺参数为提取温度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ g，乙醇浓度55.76%，pH值1，在该条件下提取1 h花色苷的实际提取量为 9.68 mg/100 g，而在此基础上使用超声波提取40 min，提取量达到14.04 mg/100 g，提高了提取效率。同时所提黑青稞花色苷的抗氧化活性较强，且抗氧化能力与花色苷浓度间存在剂量效应关系；与维生素C（vitamin C，简称VC）相比，黑青稞花色苷清除DPPH自由基和羟自由基能力较强，但还原能力和清除超氧阴离子能力没有VC强。黑青稞花色苷对自由基的清除能力大小依次为DPPH自由基>羟自由基>超氧阴离子自由基，半抑制浓度（50% inhibitory concentration，简称IC50）依次为0.186、0.268、0.293 mg/mL，说明黑青稞花色苷是一种较好的天然抗氧化剂。

关键词：黑青稞；花色苷；响应面法；提取工艺；抗氧化活性

中图分类号： S512.301 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0173-06

收稿日期：2016-04-20

基金项目：云南农业大学创新基金。

作者简介：杜道坤（1989—），男，河南信阳人，硕士研究生，主要从事作物遗传和品种改良研究。E-mail：490041070@qq.com。

通信作者：康志钰，博士，副教授，主要从事作物遗传育种及种子科学与工程方面的研究。E-mail：zhiyukang@163.com。青稞（Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook.f.）在植物分类学上为禾本科大麦属普通大麦种多棱裸粒大麦变种[1]。我国拥有丰富的青稞资源，品种繁多、种类各异，其中黑青稞是一种独特的种质资源，具有很大的开发价值。黑青稞种皮中含有丰富的花色苷而区别于普通白青稞，单月琴就从囊谦黑青稞的酸性乙醇提取液中鉴定出可能的7种花色苷[2]。花色苷是一种的水溶性的天然色素，它主要存在于植物的花、果实、种子中，从而使它们呈现出黑、紫、蓝等多种颜色。现代研究证明，人工合成的色素对人类的健康存在潜在的致畸性、致癌性[3]，而天然色素花色苷不仅无毒无害，还具有清除自由基、防癌抗肿瘤、清脂减肥等与人类健康息息相关的功能[4-6]，所以黑青稞具有生产天然色素的开发和利用前景，而提取其中的花色苷是利用黑青稞的第1步，研究其提取工艺具有重要意义。

不同的提取条件对黑青稞花色苷的提取效果存在不同的影响。响应面分析法（response surface methodology，简称RSM）就是使用多元二次回归方程来拟合多个提取条件（因素）与试验指标（响应值）之间的函数关系，并通过分析回归方程来优化工艺参数，它保留了正交試验工作量少的优点，还克服了不能在整个区域上得出最佳因素组合和最优值的缺点[7-8]。陈建国等使用这种方法以黑青稞种子粉为材料优化了其花色苷的提取工艺[9]。但是青稞种子中淀粉成分独特，普遍含有74%～78%的支链淀粉，有的甚至更高[10]，使用种子粉提取在加热的过程中使提取液变得黏稠、糊化而影响测定结果，且黑青稞花色苷多数集中在种皮，所以本研究以去杂的、完整的黑青稞种子为材料，使用响应面法优化其提取工艺，并初步探索超声波辅助提取黑青稞花色苷，同时测定所得花色苷提取液的抗氧化活性，旨为黑青稞天然色素的进一步研究和开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以云南省当地种皮颜色为黑色的青稞为材料。

主要试剂有甲醇、乙醇、盐酸、三氯乙酸、柠檬酸、冰乙酸、甲酸、乙酸乙酯、30%双氧水、硫酸亚铁、水杨酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，简称DPPH）、铁氰化钾、氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tris-base、邻苯三酚，均为分析纯。

1.2 仪器设备

主要仪器有Agilent Cary60紫外-可见光分光光度计（美国安捷伦公司）、Alpha 1-2型冷冻干燥机（德国Martin Christ公司）、RE-52B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、予华SHZ-D型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）、KQ32001超声波震荡器（东莞市柯桥超声波设备有限公司）、YXT-2型高速电动离心机、恒温水浴锅、电子天平等。

1.3 试验方法

1.3.1 黑青稞花色苷吸收波长的选择参照孙荣琴等的方法[11]，使用1%盐酸甲醇进行提取，将提取液离心定容后再用紫外-可见光分光光度计（Agilent Cary 60）进行250～700 nm的扫描，确定可见光区内最大吸收波长（λmax）。

1.3.2 单因素试验设计以黑色种皮的青稞种子为材料，分别考察种子粉碎与未粉碎、提取剂、乙醇浓度、提取剂pH值、酸化剂、提取温度、提取时间、液料比8个单因素对黑青稞籽粒花色苷提取量的影响。

1.3.2.1 种子粉碎与未粉碎的选择分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子和过60目筛网的黑青稞种子粉，按照 10 mL ∶ 1 g 的液料比，以盐酸为酸化剂，配制pH值=3的60%乙醇，在温度为50 ℃的水浴条件下提取1 h。

1.3.2.2 提取剂的确定分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以盐酸为酸化剂，分别配制pH值=3的蒸馏水、60%甲醇、纯甲醇、60%乙醇、纯乙醇，在温度为50 ℃的水浴条件下提取1 h。endprint

1.3.2.3 乙醇浓度的选择分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以盐酸为酸化剂，分别配制pH值=3的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，在温度为50 ℃的水浴条件下提取1 h。

1.3.2.4 pH值的确定分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以盐酸为酸化剂，分别配制pH值为1、2、3、4、5的60%乙醇，在温度为50 ℃的水浴条件下提取1 h。

1.3.2.5 酸化剂的选择分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，分别以盐酸、三氯乙酸、冰乙酸、甲酸、柠檬酸为pH值调节剂，配制pH值=3的60%乙醇在温度为50 ℃的水浴条件下提取1 h。

1.3.2.6 提取温度的确定分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以盐酸为酸化剂，配制pH值=3的60%乙醇，分别在温度为30、40、50、60、70、80 ℃的水浴条件下提取1 h。

1.3.2.7 提取时间的确定分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以盐酸为酸化剂，配制pH值=3的60%乙醇，在温度为50 ℃的水浴条件下分别提取0.5、1、2、3、4、5 h。

1.3.2.8 液料比的确定分别称取1 g去杂的完整黑青稞种子，分别按照5 mL ∶ 1 g、10 mL ∶ 1 g、20 mL ∶ 1 g、30 mL ∶ 1 g、40 mL ∶ 1 g、50 mL ∶ 1 g的液料比，以盐酸为酸化剂，配制pH值=3的60%乙醇，在温度为50 ℃的水浴条件下分别提取1 h。

1.3.3 花色苷提取量的测定将按照以上单因素试验所确定的提取条件得到的提取液离心后，以提取剂为空白对照，在λmax处测定吸光度，参考赵桃等的方法[12]计算得出提取量，均平行测定3次，相关公式：

提取量（mg/100 g）=D×V×N×10098.2×m。

式中：D为在λmax处的吸光度；V为稀释体积，mL；N为稀释倍数；98.2为花色素的平均消光系数；m为样品干质量，g。

1.3.4 黑青稞花色苷的响应面试验及模型验证根据单因素试验结果，选取对黑青稞花色苷提取量影响较大的4个因素提取温度（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）、pH值（D）作为影响因子，以提取量作为响应值，根据Box-Benhnken中心组合设计原理使用4因素3水平试验设计（表1）。利用 Design-Expert 8.06软件对数据进行分析。用响应面法分析得出的黑青稞花色苷最佳提取条件进行验证，算出实际提取

量与模型的预测值进行比较。

1.3.5 超声波辅助提取试验根据所得最佳提取条件，为进一步缩短提取时间，进行超声波辅助提取试验，超声波分别提取20、40、60、80 min后测定提取量，平行测定3次。

1.3.6 抗氧化性的测定根据“1.3.4”节优化的提取条件提取黑青稞中的花色苷，滤液经乙酸乙酯萃取3次进行纯化，40 ℃下旋转蒸发至溶液黏稠，最后置于冷冻干燥机中获得紫色冻干粉，然后用60%乙醇溶液配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的黑青稞花色苷溶液进行抗氧化性的研究，使用相同浓度的维生素C（vitamin C，简称VC）溶液作为阳性对照。

1.3.6.1 还原能力的测定参考莫开菊等的方法[13]。采用普鲁士法，分别准确移取1.0 mL不同浓度样品于干燥试管中，再依次加入3.0 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值=6.6）、2.5 mL 1%六氰合铁酸钾溶液，于50 ℃水浴保温 20 min 后，迅速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，离心，取3.0 mL上清液，再依次加入3.0 mL蒸馏水，0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后，室温静置10 min，再在波长700 nm处测定其吸光度。

1.3.6.2 DPPH清除能力参考朱璐等的方法[14]。精确称取2.5 mg DPPH粉末，用无水乙醇定容至100 mL，避光保存备用。分别取1.0 mL不同浓度的样品溶液于试管中，再加入2.0 mL DPPH溶液，摇匀后室温避光保存30 min，以无水乙醇作为空白对照，在517 nm处测吸光度。计算清除率，并計算当清除率达到50%时所需的浓度，即IC50值，清除率计算公式如下：

清除率=（1-D1（517 nm）-D2（517 nm）D0（517 nm））×100%。

式中：D0（517 nm）为不加样品溶液的空白管溶液的吸光度；D1（517 nm）为反应溶液的吸光度；D2（517 nm）为不加DPPH溶液的对照管吸光度。

1.3.6.3 羟自由基清除能力参考赵桃等的方法[12] 取干燥试管，依次加入1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2、1.0 mL 10 mmol/L FeSO4、1.0 mL 10 mmol/L水杨酸乙醇溶液，再加入1.0 mL样品溶液，最后加入1.0 mL H2O2于37 ℃水浴中反应0.5 h，以蒸馏水作为对照，在510 nm处测吸光度，计算清除率：

清除率=（1-D1（510 nm）-D2（510 nm）D0（510 nm））×100%。

式中：D0（510 nm）为不加样品溶液空白管溶液的吸光度；D1（510 nm）为反应溶液的吸光度；D2（510 nm）为含1.0 mL H2O2和1.0 mL样品溶液对照管的吸光度。

1.3.6.4 超氧阴离子自由基清除能力参考资名扬等的方法[15] 采用邻苯三酚自氧化速率法，取干燥试管加入 4.5 mL pH值=8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液和4.5 mL蒸馏水，混合后在25 ℃恒温水浴中保温20 min，然后加入于25 ℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，迅速摇匀后倒入比色皿，每隔0.5 min在波长320 nm处测定溶液的吸光度，至5 min后停止。计算线性范围内1 min吸光度的增加值（ΔD0（320 nm））。在加入邻苯三酚前，先加入1.0 mL样品溶液，蒸馏水3.5 mL，从而得到ΔD320 nm，按下式计算清除率：endprint

清除率=ΔD0（320 nm）-ΔD320 nmΔD0（320 nm）×100%。

式中：ΔD0（320 nm）表示邻苯三酚自氧化速率；ΔD320 nm表示加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

2 结果与分析

2.1 黑青稞花色苷吸收波长的确定

由图1可知，黑青稞花色苷提液叶在紫外区270～280 nm 和可见光区500～550 nm之间均有吸收峰出现，分别为275、528 nm，符合花色苷特征吸收峰的范围，在324 nm处有吸收峰，则表示该色素分子结构具有酰化基团[16]。因此确定黑青稞花色苷测定波长为528 nm。

2.2 花色苷提取的单因素试验结果

2.2.1 籽粒粉碎与未粉碎的影响由图2-A可看出，完整种子的花色苷提取量高于过60目筛的黑青稞种子粉，这是由于黑青稞种子中含有大量的支链淀粉[10]，在加热过程中造成溶液黏稠不利于色素的溶解。因此，以后试验均采用完整的种子浸提。

2.2.2 提取剂的影响由图2-B可看出，以60%甲醇为提取剂时花色苷提取量最高，其次为60%乙醇，100%乙醇的花色苷提取量最低，说明水能促进色素的溶解。由于甲醇对人体毒性较强，而乙醇无毒且易回收，因此一般选用一定浓度的乙醇溶液作为提取剂。

2.2.3 乙醇浓度的影响由图2-C可知，随着乙醇浓度的增大，花色苷提取量先升高后下降，当乙醇浓度达到60%时，花色苷提取量最高，当超过60%后，花色苷提取量便开始下降。由于水能渗透进植物细胞，因此适量的水有利于花色苷从细胞中渗出。由此可知，60%乙醇溶液提取效果最好。

2.2.4 提取液pH值的影响由图2-D可知，当提取液pH值为2时花色苷提取量最高，之后随着pH值的升高，花色苷提取量开始下降。酸性溶剂能破坏细胞膜从而有利于水溶性色素的溶解，但过高的pH值会使溶液中花色苷的结构向无色的查耳酮转变，稳定性变差[17]。本试验结果表明，黑青稞花色苷溶液在pH值为2时比较稳定。

2.2.5 溶液酸化剂的影响由图2-E可知，经盐酸酸化的提取剂提取花色苷的提取量最高，其次为甲酸，柠檬酸的提取量最低，所以以盐酸作为下步试验的酸化剂。该结果与赵桃等的研究结果[12]不一致，可能是其他提取条件不一样或不同黑青稞材料的花色苷对各酸化剂的适应性不同所致。

2.2.6 提取温度的影响由图2-F可知，随着提取温度的升高，黑青稞花色苷提取量先升高后降低，在50 ℃时提取量达到最大值，此时再提高温度，就会对花色苷的结构造成破坏，促进其降解，从而使提取量降低。

2.2.7 提取时间的影响由图2-G可知，随着提取时间的延长，花色苷提取量也在逐渐提高。提取时间从0.5 h升到 1 h 时，黑青稞花色苷提取量提高明显，而后再增加提取时间，提取量虽有提高但它们之间变化并不明显。过长的提取时间可能会促进杂质的渗出和花色苷受热降解，所以选择提取时间为1 h。

2.2.8 液料比的影响由图2-H可知，随着液料比的增大，花色苷提取量先提高后变化平缓，10 mL ∶ 1 g液料比的提取量最高。当液料比超过10 mL ∶ 1 g时，增加液料比对提取效果影响并不明显，并且过量的提取剂会增加浓缩的时间与成本。

2.3 数学模型与方差分析结果

根据单因素试验结果，选取提取温度（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）、pH值（D）等4个对黑青稞花色苷提取量影响较大的因素为自变量，以提取量为响应值的响应面分析结果如表2所示。

使用Design-Exper 8.06软件对试验结果进行多元回归拟合，得到以提取量（Y）为目标函数，提取温度（A）、液料比（B）、乙醇浓度（C）、pH值（D）为自变量的二次多元回归方程：

Y=-38.976 43+0.869 28A-0.230 19B+0.767 75C+2.072 51D-4.582 05×10-3AB-6.587 25×10-4AC-0.067 739AD+0.0244 27BC-0.078 494BD+0.040 462CD-5.445 78×10-3A2-0.038 747B2-9.091 41×10-3C2-0.795 13D2。

由表3可知，该模型P<0.000 1，极显著。模型R2为0963 2>0.900，说明相关性良好，即该模型可以解释 96.32%的数据。失拟项不显著，表明回归方程对试验数据拟合度高，可以使用该模型进行分析和预测。对模型中各回归系数进行显著性检验发现，A、D因素对提取量的影响极显著，各因素对提取量的影响从大到小排序为pH值>提取温度>液料比>乙醇浓度，并且温度和pH值交互影响显著，液料比和乙醇浓度交互影响极显著。

2.4 响应面结果分析

响应曲面能直观反映各因素间的相互作用，由上述研究结果可知AD、BC交互作用分别为显著、极显著，使用 Design-Exper 806软件得到相应的响应曲面和等高线，如图3、图4所示。随着pH值、液料比、乙醇浓度这3个因素的增大或减小，对提取量的影响较大，并且pH值对提取量变化的影响极显著。

通过软件对方程进一步分析得出，黑青稞花色苷提取的最佳条件为提取温度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ 1 g，乙醇浓度55.76%，pH值=1，在此条件下提取量的预测值为 9.29 mg/100 g。

2.5 模型验证和超声波辅助提取

对根据模型得到的提取黑青稞花色苷的最佳条件进行验证，平行测定3次得到的实际提取量平均值为9.68 mg/100 g，

與模型理论值9.29 mg/100 g很接近，表明该模型对黑青稞花色苷的提取具有一定实际应用价值。endprint

在最优提取条件的基础上使用超声波辅助提取黑青稞总花色苷的结果如图5所示，可见随着超声时间的延长，黑青稞花色苷提取量也在不断提高。这是由于超声波增强了溶剂的水合与渗透作用，加速了花色苷的溶出。超声波处理20 min后花色苷提取量为11.15 mg/100 g，不仅比浸提法提取1 h得到的提取量要高1.47 mg/100 g，还缩短了时间，超声40 min后花色苷提取量为14.04 mg/100 g，随后增加超声时间对提取量的变化并不明显，超声80 min时花色苷提取量为 15.03 mg/100 g，而且超声时间过长，也会促进糖、淀粉等其他杂质的渗出而造成溶液黏稠，增加了纯化的难度，因此超声时间以40 min为宜。

2.6 黑青稞花色苷的抗氧化性

利用反应体系中的还原物质可将Fe3+还原成Fe2+，从而使溶液颜色加深，因此吸光度越高，溶液中物质的还原能力越强。由图6-a可见，随着黑青稞花色苷、维生素C浓度的增大，吸光度也在增大，说明还原能力也越来越强。黑青稞花色苷浓度与吸光度之间的相关系数为0.958，呈显著正相关，维生素C浓度与吸光度之间的相关系数为0.982，呈极显著正相关，说明还原能力与它们的浓度之间关系密切，并且总体上黑青稞花色苷的还原能力不如维生素C。

DPPH由于自身特殊的分子结构，在517 nm下有强烈吸收峰，并且它的乙醇溶液肉眼观察下为紫色，抗氧化剂有供氢能力，可与DPPH的孤对电子配对使其原有结构破坏，颜色变浅，吸光度降低，抗氧化性也就越强。通常以IC50（即清除率过半时抗氧化剂的浓度）来表示抗氧化能力，其值越小抗氧化能力越强。由图6-b可见，随着花色苷、维生素C浓度的增大，它们对DPPH自由基的清除能力也在逐渐增强。黑青稞花色苷、维生素C的浓度（x，mg/mL）与DPPH自由基清除率（y，%）的回归方程分别为y=92.423x+32.793、y=87263x+22.785，r2分别为 0.964 3、0.992 9，说明它们的线性关系良好。由此得出，花色苷、维生素C的IC50分别为0186、0.311 mg/mL，说明黑青稞花色苷清除DPPH能力要好于维生素C，清除效果约为维生素C的2倍。

利用水杨酸与抗氧化剂相互竞争溶液中羟自由基的能力，使原本水杨酸与羟自由基生成的物质颜色变浅，因此可在510 nm下测定吸光度的变化来反映该物质的清除能力，通常

用IC50表示。羟自由基是对生物体危害最大的自由基，可使红细胞失活，降解DNA、细胞膜和多糖化合物，从而引起器官、组织病变[18]。由图6-c可知，黑青稞花色苷和维生素C都有一定的清除羟自由基能力，其清除率随浓度增大而提高，线性关系较好。同样得出黑青稞花色苷对羟自由基的IC50为0.268 mg/mL，维生素C对羟自由基的IC50为 0.406 mg/mL，说明黑青稞花色苷的羟自由清除能力要好于维生素C。

由于邻苯三酚碱性溶液在自然状态下几十秒后会产生超氧阴离子，并进一步产生具有颜色的中间物质，该物质的吸光度可随时间的延长而呈线性增加，当有抗氧化剂加入时可抑制该物质的生成而被用来测定抗氧化性，通常用IC50表示。超氧阴离子自由基不仅自身具有一定破坏性，它还会继续反应产生其他氧自由基，对生物体的损坏作用进一步加大[19]。由图6-d可见，随着花色苷、维生素C浓度的增大，它们对超氧阴离子自由基的清除能力呈现递增的趋势，具有较好的线性关系。同样得出黑青稞花色苷对超氧阴离子自由基的IC50为 0.293 mg/mL，维生素C对超氧阴离子自由基的IC50为0.239 mg/mL，说明维生素C对超氧阴离子的清除效果要略好于黑青稞花色苷。

3 结论

因为众多提取条件都会对黑青稞花色苷提取量具有不同程度的影响，所以先根据单因素试验结果，选取对提取量影响较大的提取温度、乙醇浓度、液料比、pH值4个因素，以提取量为响应值，使用响应面分析法优化提取条件，结果为提取温度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ 1 g，乙醇浓度55.76%，pH值=1，在此条件下提取1 h的提取量的实测值为9.68 mg/100 g；并且各因素对黑青稞花色苷提取量影响的大小顺序为pH值>提取温度>液料比>乙醇浓度。在此基础上超声波辅助提取40 min，提取量为14.04 mg/100 g，不仅缩短了提取时间还提高了提取量，是一种缩短提取时间的有效方法。

通过测定还原能力、清除DPPH自由基能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力发现，黑青稞花色苷具有一定的抗氧化活性，与维生素C相比，其清除DPPH自由基和清除羟自由基能力较强，但还原能力和清除超氧阴离子自由基能力沒有维生素C强。它对自由基的清除能力大小依次为DPPH自由基>羟自由基>超氧阴离子自由基，IC50依次为0.186、0.268、0.293 mg/mL，是一种较好的天然抗氧化剂。

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