双向电泳中不同样品裂解液对水稻叶片疏水蛋白溶解效果比较

王琳+范云峰+粱建生

摘要：为更好地溶解水稻叶片疏水蛋白，比较4种常用裂解液{分别含有4% 3-[（3-胆酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸（CHAPS）、2% CHAPS+2% SB3-10、4% ASB-14、4% TritonX-100去垢剂}配方对水稻叶片疏水蛋白溶解性的影响。结果表明，含有4% CHAPS去垢剂的裂解液对水稻叶片疏水蛋白的溶解效果最佳。

关键词：双向电泳；裂解液；疏水蛋白；溶解效果

中图分类号： S188；S511.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0054-02

收稿日期：2017-3-23

基金项目：国家自然科学基金（编号：31271622）；扬州大学科技创新培育基金（编号：2016CXJ087）。

作者简介：王 琳（1978—），女，江苏徐州人，博士，讲师，主要从事植物生理和生化研究。E-mail：wanglin@yzu.edu.cn。

通信作者：梁建生，博士，教授，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。Tel：（0514）87979054；E-mail：jssliang@163.com。 双向电泳（2-DE）中样品裂解液发展最大的限制来源于既要尽可能充分地溶解样品，又要保证不影响等電聚焦（isoelectric-focusing，简称IEF）。对于膜蛋白，用脲和硫脲组合作为离液剂已成共识[1-5]，所以选择恰当的去垢剂是改进裂解液配方的突破口。去垢剂主要有离子型、非离子型和兼性离子型3类。离子型去垢剂一般不用于IEF，以十二烷基硫酸钠（SDS）为代表。传统的非离子型去垢剂多以聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）和脂肪醇聚氧乙烯醚（NP-40）为代表，兼性离子型以3-[（3-胆酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸（CHAPS）为代表。CHAPS有较强的溶解疏水蛋白的能力，现在较为常用。此外，一些新的兼性离子去垢剂如SB3-10、氨基磺酸甜菜碱-14（ASB-14）也越来越多地被应用到2-DE中。有研究认为，SB3-10、ASB-14溶解膜蛋白的效果更好一些[6]。另外有研究发现，ASB-14溶解膜蛋白的效果优于SB3-10和CHAPS的组合[7]。但对于水稻叶片疏水蛋白的溶解效果，哪种去垢剂最好，目前的研究还没有确定的答案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以水稻品种日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）为试验材料。

1.2 试剂

双向电泳系统（Bio-RAD）、线性固相pH梯度（immobilize pH gradients，简称IPG）预制胶条（Bio-RAD），IPG缓冲液、覆盖液、3-[（3-胆酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸购自Amersham pharmacia公司；尿素、四甲基乙二胺（TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二硫苏糖醇（dethilthreitol，简称DTT）、甘氨酸、过硫酸铵、甲叉双丙烯酰胺均购自Amresco公司；其他常用试剂为国产分析纯；所有溶液和缓冲液均使用MilliQ系统提供的电阻不小18.2 MΩ的去离子水。

1.3 水稻叶片疏水蛋白的制备、沉淀与保存

取水稻鲜叶约10 g，冻干，用粉碎机粉碎冻干叶片，筛出叶片粉末，加入40 mmol/L Tris-HCl（pH值8.4），振荡 10 min，超声波处理1 min，4 ℃、21 697 r/min离心1 h，取上清，留沉淀，反复多次，直至Bradford法测得的上清液蛋白质浓度为0，最终沉淀中所含的蛋白质即为水稻叶片的疏水蛋白，将沉淀真空冻干，于-78 ℃保存。

在水稻叶片疏水蛋白冻干粉中加入250 μL 4种不同的裂解液A（含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS）、裂解液B（含7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，2% CHAPS和2% SB3-10）、裂解液C（含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% ASB-14）和裂解液D（含 7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4% TritonX-100），30 ℃水浴 1 h，其间充分振荡，超声波处理3次（50 s/次），20 ℃、14 953 r/min 离心15 min，取上清，用Bradford法测上清液的蛋白质浓度。

1.4 双向电泳

配制含150 μg蛋白质的水化液，重水化pH值4～7的IPG胶条，等电聚焦35 000 Vh。平衡胶条。将胶条移至二向12.5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶上，进行二向电泳，电泳结束后剥胶，银染法染色显示蛋白质点[8]。扫描仪扫描双向电泳凝胶图并进行分析。

2 结果与分析

目前针对膜蛋白质的溶解有多种方法，在不同情况下其溶解效果不同，但在特定情况下却各有优势。在2-DE中，对膜蛋白的溶解用脲和硫脲的组合作为离液剂已成共识，所以各种膜蛋白质裂解液的最大不同来自于对不同的非离子型或兼性离子型去垢剂的使用。本试验比较了目前在2-DE膜蛋白质溶解中应用较为普遍的4种裂解液[9-12]的蛋白溶解效果。

从图1可以看出，虽然是相同的上样量 100 μg，但是A、B、C、D 4种裂解液的结果却是有差别的。A和B要好于C和D，因为A和B的2-DE图谱上有更多蛋白质点（接近1 500个），C和D只有1 200个左右的蛋白质点。在本试验中 ASB-14会使分子量较低的蛋白质在酸性端模糊难辨（图1-C的Ⅰ区域）。这种结果不但使2-DE的覆盖率大大降低，而且会影响到2-DE的重复性，从而增大了变异系数和分析难度，影响结果的准确性。图1-D的区域Ⅱ、Ⅲ与图1-A和图1-B中的相同区域相比，不但蛋白质点数少，而且相同蛋白质的灰度值也不及图1-A和图1-B，但是图1-D的这2个区域与图1-C相比，结果较好。因此认为在2-DE中，用裂解液A和B溶解水稻叶片的疏水蛋白的效果要好于D，D的效果优于C。endprint

2-DE是全面分析蛋白质的技术，比较A和B，虽然两者都有高效溶解蛋白质的能力，但是两者对特定蛋白质的溶解能力却是不同的。在图1-A、图1-B中示意了对应的区域1、2、3和4，在这些区域中可以发现A和B的溶解效力还是有细微差异的。如在区域1和4，A要优于B；在区域3，B要优于A；在区域2，两者各自溶解了不同的蛋白质。总的来说，含有4%CHAPS去垢剂的裂解液对水稻叶片疏水蛋白的溶解效果最佳。

3 讨论与结论

目前有研究认为SB3-10、ASB-14溶解膜蛋白的效果较好[6]，而ASB-14的溶解能力相对于SB3-10/CHAPS则更强[7]。本试验通过比较了几种常用的裂解液对水稻叶片疏水蛋白的溶解效果后发现，CHAPS（4%）的溶解效果最好，CHAPS（2%）和SB3-10（2%）的组合次之，TritonX-100（4%）溶解效果较差，而ASB-14（4%）由于易造成酸性端低分子量区域模糊，因此效果最差。

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