土家族麝针疗法“活血生新”治疗缺血性脑中风的作用机制研究❋

涂 星，张 燕，文德鉴，胡泽华，郜红利，向 阳，袁德培，王利胜

(1. 湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000； 2. 湖北民族学院土家医药研究所，湖北 恩施 445000； 3. 广州中医药大学，广州 510405)

【针灸研究】

土家族麝针疗法“活血生新”治疗缺血性脑中风的作用机制研究❋

涂 星1,2，张 燕1，文德鉴1,2，胡泽华1,2，郜红利1,2，向 阳1，袁德培1,2，王利胜3

(1. 湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000； 2. 湖北民族学院土家医药研究所，湖北 恩施 445000； 3. 广州中医药大学，广州 510405)

目的：探讨土家族麝针疗法治疗缺血性脑中风的作用机制，揭示其活血化瘀诱导血管新生的药理作用。方法：采用改良线栓法建立缺血性脑中风大鼠模型，以Zea-longa为1～3分的大鼠为研究对象，以土家族麝针疗法干预3个疗程后，TTC染色法观察其对大脑梗死灶体积的影响，激光散斑成像技术观察其对脑皮质区整体血流速度的影响，western-blot法测定血管内皮生长因子(VEGF)及其受体1(VEGFR1)的表达水平。结果：与正常组比较，缺血性脑中风大鼠脑梗死体积显著增加，脑皮质区血流速度明显减缓，脑组织中VEGF蛋白和VEGFR1蛋白表达水平均显著增加；经给予土家族麝针疗法治疗后，脑梗死体积显著降低，脑皮质区的血流速度显著加快，脑组织中VEGF蛋白和VEGFR1蛋白表达水平显著增加，且其影响随着疗程的延长更为显著。结论：土家族麝针疗法能显著改善缺血性脑中风所致的脑梗死体积，其“活血生新”的作用机制可能与改善脑皮质区的血流速度、增加血管内皮细胞生长因子及其受体表达水平有关。

土家族麝针疗法；缺血性脑中风；活血生新；激光散斑成像技术；血管内皮细胞生长因子及受体-1

脑中风是世界第三大致死病因，其中80%为缺血性脑中风，且其发病率呈急剧上升趋势，并具有较高的致残率和致死率，目前我国缺血性脑中风致残率高达72%以上[1-2]。缺血性脑卒中是由于各种原因引起的局部脑组织供血不足或供血障碍，导致脑组织发生缺血缺氧性坏死。其主要发病机制是由于脑组织发生动脉粥样硬化，导致患者血管腔出现狭窄、痉挛，进而血液的凝聚性增高、黏度增加或者血流动力学改变等原因，使患者脑内局部动脉供血不足，发生脑组织急性缺血、缺氧、坏死等严重损伤，从而在患者全身表现出一系列的临床症状[3-4]。

研究显示[5-6]，啮齿类动物在脑缺血发作的数分钟内与血管生成有关的基因就被上调，而与血管生成有关的蛋白则在数天至数周内都能保持高水平；而尸体解剖时发现，脑组织缺血边缘区存在血管生成增加的现象，而老龄患者该现象明显减少。动物模型和人类脑卒中患者的研究提示，中风后血管生成可能与改善功能结局有关，可能是由于机体对缺血损伤产生响应而出现“促血管生成状态”[7]。

前期研究发现[8]，土家族麝针疗法对缺血性脑中风大鼠的血液流变学具有较好的改善作用，那么该疗法是否能通过改善血液流变学，调节与血管生成相关的细胞因子或蛋白的释放与表达，促进微血管新生而达到治疗缺血性损伤的作用呢？本研究拟采用激光散斑成像技术、Western-blot等技术方法对该假设进行验证，以期揭示土家族麝针疗法治疗缺血性脑中风的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级、健康SD大鼠240只，雌雄不限，5～7周龄，体质量(200±20) g，购于安陆瑞森实验动物有限公司(许可证号SCXK(鄂)2014-0016)。饲养环境温度(20±2) ℃，湿度55%～75%，12 h/12 h光暗体系。

1.2 药物与试剂

土家族麝针(实验室自制)；人工麝香(纯麝香粉，批号20141025，安徽亳州国药中药草堂)；水合氯醛(CP，批号150307，广州化学试剂厂)；TTC染色液(宝生物工程大连有限公司)； 0.01MPBS缓冲液、SP免疫组化染色试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)；兔抗大鼠 VEGF 及 VEGFR1多克隆抗体(美国Pepro Tech)，羊抗兔二抗、蛋白marker(上海歌帆生物科技有限公司)；考马斯亮蓝G250(上海源叶生物)；其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

激光散斑成像系统；十万分之一岛津电子分析天平(日本岛津)；5810R高速冷冻离心机(德国eppendorf)；OLYMPUS直立光照照相系统(日本OLYMPUS)、微量移液器(德国eppendorf)；电泳装置、转移装置、恒流恒温电泳仪、脱色摇床(美国BIO-RAD)；SHA-B恒温水浴锅(金坛精达仪器制造厂)等。

2 方法

2.1 造模与分组

大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法分成正常组60只和模型组180只，模型组大鼠10%水合氯醛固定于大鼠脑立体定位仪上，以高速电动颅钻在保持硬脑膜完好的前提下打磨颅骨形成一个10×15 mm的颅骨窗(定位为前至前囟，左至矢状缝，右至右侧颞线，后至冠状缝)。参考前期研究[8]，采用改良线栓法建立缺血性脑中风大鼠模型，以Zea-longa评分为1～3分的大鼠(145只，造模成功率80.56%)随机分为模型组65只和土家族麝针治疗组80只。在实验过程及颅骨打磨过程死亡，土家族麝针治疗组剩余大鼠58只，模型组60只纳入研究。

2.2 土家族麝针的制备和治疗

分别称取人工麝香10 g溶于100 ml 95%乙醇溶液中，待完全溶解呈淡黄棕色溶液后，将5号一次性注射针头浸泡入内1周后取出，以显微镜下观察针头部附着黄色结晶物为成功的麝针。土家族麝针组大鼠以俯卧位固定，选取其对侧头皮的运动区、感觉区和足运感区。采用自制麝针进针，针应刺在肌层，以200次/min以上的速度快速捻针，至针刺区微感发热。捻转5 min后，留针5 min，反复捻针留针3次后起针，每日进行2次，5 d为1个疗程，每疗程间休息2 d，治疗3个疗程。正常组和模型组同法按照土家族麝针组固定30 min，不做其他处理。

2.3 脑组织梗死灶体积检测

分别于治疗前、1疗程、2疗程和3疗程结束时随机取各组大鼠2只，脱颈椎处死后立即剥离完整脑组织，0 ℃生理盐水中漂洗干净，置于-20 ℃冰箱中冷冻保存30 min后，切取5片2 mm厚度的冠状切片，进行TTC染色后37 ℃正反面各孵育15 min，使正常脑组织染色深红色，缺血脑组织呈苍白色，4%多聚甲醛固定后，徕卡相机拍照后以Image impro Plus 6.0软件对图像进行分析并计算梗死体积。梗死体积百分比=(正反面梗死体积之和/2×片厚)/(正反面总面积之和/2×片厚)×100%。

2.4 大脑皮质区整体血流速度检测

分别于治疗前、1疗程、2疗程和3疗程结束时随机取各组大鼠6只，在激光散斑成像系统下观察大脑皮质区整体血流，每隔20 ms获得1帧原始图像，连续成像150帧，获取10张脑血流分布图进行统计分析。采用Image impro Plus 6.0软件对图像进行分析，以各像素平均光密度值代表该点脑血流量相对值，定义正常大鼠对应的脑血流(基础血流)对应的平均光密度为100%，以各时间点平均光密度值与正常大鼠光密度值的百分比代表血流量相对基础血流的变化。

2.5 血管内皮细胞生长因子及其受体表达量检测

分别于治疗前、1疗程、2疗程和3疗程结束时随机取各组大鼠6只，脱颈椎处死后立即剥离完整脑组织，用吸水滤纸吸干表面水分，称取脑组织总重量，参考文献[9]测定目的蛋白条带和内参蛋白条带的灰度值，以目的蛋白/内参蛋白的比值作为该样本蛋白表达水平进行统计分析。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 对脑梗死体积和大脑皮质区血流速度的影响

表1图1显示，治疗前与正常组比较，模型组和土家族麝针疗法组相对脑梗死体积显著增加(P<0.05)，血流速度明显减缓(P<0.05)，且土家族麝针疗法组和模型组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示本研究所建立的模型是成功的，且治疗组和对照组基线平衡。土家族麝针疗法组在1疗程时脑梗死体积与治疗前比较差异无统计学意义(P<0.05)，在2疗程和3疗程时较模型组和1疗程时显著降低(P<0.05，P<0.05)，且3疗程时比2疗程显著降低(P<0.05)，提示土家族麝针疗法改善脑梗死体积与治疗疗程有关，疗程越长改善的效果越显著；而土家族麝针疗法组在1疗程、2疗程和3疗程时大脑皮质区整体血流速度较治疗前与模型组均明显提高(P<0.05，P<0.05)，且3个疗程整体血流速度比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.05)，存在显著疗程依赖性。

表1 土家族麝针疗法对各组大鼠不同疗程脑梗死体积和皮质区血流速度的影响(n=10或

注：与正常组比较:▲P<0.05；与模型组比较:★P<0.05；与治疗前比较:aP<0.05；与1疗程比较：bP<0.05；与2疗程比较:cP<0.05

图1 各组大鼠不同疗程大脑皮质区整体血流激光散斑成像图

3.3 对血管内皮细胞生长因子及其受体1表达量的影响

表2图2、3显示，治疗前与正常组比较，模型组和土家族麝针组大鼠脑组织中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体-1(vascular endothelial cell growth factor recptor-1，VEGFR1)蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，且土家族麝针疗法组和模型组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)；土家族麝针疗法组在1疗程、2疗程和3疗程时VEGF表达量较治疗前和模型组均显著增加(P<0.05，P<0.05)，且其表达量随疗程的延长显著增加(P<0.05，P<0.05，P<0.05)；在2个疗程和3个疗程时VEGFR1表达量较治疗前、1个疗程和模型组均显著增加(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，且其表达量随着疗程的的延长显著增加(P<0.05，P<0.05)。

4 讨论

麝针疗法是土家族民间流传甚久的一种常用治疗方法，对脓疱、疖肿、疔疮、关节扭伤所致肿胀瘀血疼痛、急症暴症、伤寒头痛等均有较好的疗效。麝针是用香獐子的门牙制成，抓捕时扣掉牙(长约5～8 cm，呈半圆形，根部稍大，前端尖锐，齿内有骨髓填满)，挑出骨髓，从根部放入0.2～0.6 g麝香，然后将根部扎紧、封闭将前端磨锐即得[10]。该方法体现了传统医学中“针药结合”的治疗特色。

机体脑血流始终保持着相对恒定的循环，以维持机体的正常生理功能。研究表明[11-12]，缺血性脑中风患者全血黏度、红细胞压积和血小板最大聚集率显著增加，而凝血酶时间和凝血酶原时间显著下降。前期研究[9]证实，土家族麝针疗法可显著改善缺血性中风大鼠的全血黏度，抑制血小板最大聚集率，增加凝血酶原时间，有效防止缺血脑组织的进一步损害，但未能直观地反映血液流速的变化。目前动态监测脑血流的方法主要有Xe吸收法、单射断层扫描法、正电子发射断层扫描法和经颅多普勒超声等[13-16]。本研究采用激光散斑成像技术，通过分析时间积分上班的空间统计特性来提取血流速度信息，研究发现土家族麝针疗法能显著改善脑皮质血流速度，促进血液运行，提示该疗法具有一定的“活血”作用。

表2 土家族麝针疗法对各组大鼠不同疗程血管内皮细胞生长因子及其受体1表达量的影响

注：与正常组比较:▲P<0.05；与模型组比较:★P<0.05；与治疗前比较:aP<0.05；与1疗程比较，bP<0.05；与2疗程比较:cP<0.05

图2 各组大鼠不同疗程脑组织中VEGF(上)、VEGFR1(下)表达水平注：1.治疗前；2.1疗程；3.2疗程；4.3疗程

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为血管新生过程中的重要因子，是一种内皮细胞特异性最强、促血管构建作用最强的调节生长因子，可通过与其受体VEGFR1和VEGFR2等结合发挥生物学效应，促进胃血管内皮细胞增殖、迁移和血管新生，并可增加小静脉血管与微血管的通透性，促进血管再通[17-20]。研究表明，VEGF对缺血性脑中风有显著的血管新生和神经保护作用[21-23]，而其受体VEGFR1可促进血管内皮分化，VEGFR2可促进新生血管塑形成熟[24-25]。研究发现，大鼠脑缺血中风后，脑组织中VEGF和VEGFR1的蛋白表达量均显著增加，提示脑缺血后机体通过调节VEGF和VEGFR1的表达发挥自我保护作用；给予土家族麝针治疗后，其蛋白表达量均显著提高，提示该疗法可通过上调其表达水平达到“生新”的治疗作用。

结合土家族麝针疗法对缺血性脑中风大鼠的脑梗死体积的改善作用，初步得出该疗法可能是通过加快脑皮质血流速度，调节VEGF及其受体表达促进血管生成达到改善脑梗死的效果。由于实验条件和经费的限制，未能对VEGF的其他受体如VEGFR2、VEGFR3、激酶插入区Kappa Opioid受体(KOR)等进行检测；此外，土家族麝针疗法治疗缺血性脑中风发挥作用的到底是针刺的作用还是麝香的作用，尚有待进一步研究。

[1] 王文志.中国脑卒中流行病学特征和社区人群干预[J].中国医学前沿杂志,2009,1(2):49- 53.

[2 ] FEIGIN VL. Stroke epidemiology in the developing world[J]. Lancet, 2005, 365 (9478):2160- 2161.

[3] 吴建峰. 中西医结合治疗缺血性脑中风的疗效及对血液流变学指标的影响[J]. 现代中西医结合杂志,2014,23(34):3833-3834.

[4] BANERJEE A, ZHANG X, MANDA KR, et al. HIV proteins(gp120 and tat) and methamphetamine in oxidative stress-induced damage in the brain: potential role of the thiol antioxidant N-acetylcysteine amide[J]. Free Radic Biol Med, 2010,48(10): 1388-1398.

[5] SZPAK GM, LECHOWICZ W, LEWANDOWSKA E, et al. Border zone neovascularization in cerebral ischemic infarct[J]. Folia Neuropathol, 1999, 37(4):264- 268.

[6] HAYASHI T, NOSHITA N, SUGAWARA T, et al. Temporal profile of angiogenesis and expression of related genes in the brain after ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab， 2003, 23(2):166-180.

[7] KRUPINSKI J, ISSA R, BUJNY T, et al. A putative role for platelet-derived growth factor in angiogenesis and neuroprotection after ischemic stroke in humans[J]. Stroke, 1997, 28(3):564-573.

[8] 涂星,张燕,向阳,等.土家族麝针疗法对缺血性脑中风大鼠的脑保护作用机制研究[J].中国民族民间医药,2016,25(10):2- 7.

[9] 邵妍,王鹏琴,王树东,等. 眼针运动疗法对脑缺血再灌注大鼠脑缺血半暗带区VEGF蛋白及VEGF mRNA表达的影响[J].中国中医基础医学杂志,2015, 21(4):445- 448.

[10] 侯智利.土家族麝针疗法[N].医药养生保健报,2007-01-08(6).

[11] 王爱云,陆茵,严令耕,等.通塞脉微丸改善缺血性中风大鼠血液流变状态的实验研究[J].中国血液流变学杂志,2007,17 (1):52- 54．[12] 薛黎,曹玲,曹文艳.血液流变学检测指标对缺血性与出血性脑中风鉴别诊断的临床评价[J].新疆医科大学学报,2009,32 (11):1554-1556．

[13] 杨弋,吴江,王静,等. 颈内动脉系统 TIA 患者 Xe-CT 脑血流检测的临床意义[J].中国实验诊断学,2009,13(1):60- 62.

[14] 李文雅. SPECT脑血流灌注显像局部脑血流测定在短暂性脑缺血中的应用[J].中国医药指南,2016,14(5):87.

[15] 王前友,王文静,刘亮,等. 轻度认知障碍患者的 SPECT 与 TCD 脑血流改变[J].安徽医科大学学报,2013,48(1):69- 73.

[16] 汪恩焕,郭之通,王廷友,等.133Xe 吸入法对轻度颅脑损伤患者rCBF定量研究[J].实用全科医学,2004,2(4):304- 305.

[17] DVORAK HF. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy[J]. J Clin Oncol, 2002, 20(21): 4368- 4380.

[18] ZHANG P, LEI X, SUN Y, et al. Regenerative repair of Pifithrin-α in cerebral ischemia via VEGF dependent manner[J]. Sci Rep, 2016.

[19] 段泽星,谢立群.VEGF在肿瘤生长和血管生成中的作用[J].世界华人消化杂志,2010,18(27):2894-2900.

[20] PRADEEP CR, SUNILA ES, KUTTAN G. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors in tumor angiogenesis and malignancies[J]. Integr Cancer Ther, 2005,4(4): 315-321

[21] 杨佳佳.外源性VEGF对脑缺血模型大鼠认知能力的保护作用及机制探究[D].天津：南开大学,2014.

[22] 汤浩. 强化表达VEGF的老年人骨髓基质细胞治疗脑缺血的实验研究[D].广州：南方医科大学,2013.

[23] 陈懿,王国佐,葛金文,等. 川芎嗪对局灶性脑缺血大鼠血管内皮生长因子表达的影响[J]. 中国中西医结合急救杂志,2008,15(6):329- 331.

[24] TAKAHASHI T, TAKASE Y, YOSHINO T, et al. Angiogenesis in the developing spinal cord: blood vessel exclusion from neural progenitor region is mediated by VEGF and its antagonists[J]. PLoS One, 2015, 10(1):e0116119

[25] IMOUKHUEDE PI, DOKUN AO, ANNEX BH, et al. Endothelial cell-by-cell profiling reveals the temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane localization after murine hindlimb ischemia[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013, 304(8): H1085- 1093.

StudyonMechanismofActivatingBloodandCreatingNewBloodVesselbyMuskNeedleTherapyinTujiaMedicineonIschemicStrokeRatModel

TU Xing1, ZHANG Yan1, WEN De-jian1,2, HU Ze-hua1,2, GAO Hong-li1,2, XIANG Yang1, YUAN De-pei1,2, WANG Li-sheng3

(1.HubeiUniversityforNationalities,Hubei,Enshi445000,China;TujiaMedicineResearchInstitute,HubeiUniversityforNationalities,Hubei,Enshi445000,China;3.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

Objective: To explore the mechanism of activating blood and creating new blood vessel by musk needle therapy inTujiamedicine on ischemic stroke rat model. Methods: Ischemic stroke rat model was established by reforming Longa method. The ischemic stroke rats with the Zea-longa score 1 to 3 were divided into model group and treatment group, the latter was treated by musk needle therapy for 3 courses of treatment while the former without any further processing, the normal rats were used as the control group. Tetrazolium method was used to observe the volume of cerebral infarction, laser speckle imaging was used to observe the blood flow rate of the whole cerebral cortex and western-blot was used to detect the expression level of vascular endothelial growth factor (short for VEGF) and VEGF receptor 1. Result: Comparing with the control group, the volume of cerebral infarction, the expression level of VEGF and VEGF receptor 1 increased significantly while the blood flow rate of the whole cerebral cortex decreased significantly both in model group and treatment group. After given musk needle therapy, the volume of cerebral infarction decreased significantly while the blood flow rate of the whole cerebral cortex, the expression level of VEGF and VEGF receptor 1 increased significantly, and these results have a positive relationship with the courses of treatment. Conclusions: Musk needle therapy inTujiamedicine could significantly improve the volume of cerebral infarction caused by ischemic stroke, its mechanism of activating blood and creating new blood vessel may have something to do with its functions on increasing the blood flow rate of the whole cerebral cortex, the expression level of VEGF and VEGF receptor 1.

Musk needle therapy inTujiamedicine; Ischemic stroke; Activating blood and creating new blood vessel; Laser speckle imaging; Vascular endothelial growth factor; VEGF receptor 1

R246.8

B

1006-3250(2017)10-1445-04

湖北省教育厅科学技术研究项目(中青年人才项目)(Q20161904)-土家族麝针疗法治疗缺血性脑中风大鼠的作用机制研究

涂 星(1987-)，男，湖北黄冈人，讲师，医学博士，硕士研究生导师，从事民族医药的开发利用与保护研究。

2017-03-15