独正杆接骨膏外用对家兔骨折愈合过程中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表达的影响❋

黄 琼，向 阳

(湖北民族学院医学院,湖北 恩施 445000)

【实验研究】

独正杆接骨膏外用对家兔骨折愈合过程中BMPR-1A、BMPR-1BmRNA表达的影响❋

黄 琼，向 阳

(湖北民族学院医学院,湖北 恩施 445000)

目的：探讨独正杆接骨膏外用对家兔骨折愈合过程中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA表达的影响，分析其促进骨折愈合的作用机理。方法：建立30只家兔桡骨骨折模型按随机数字表法分为实验组和对照组各15只。实验组在其患处外敷独正杆接骨膏并用小夹板固定，对照组不使用药物仅常规消毒后进行小夹板固定。分别于治疗后第3、6、10周每组随机抽取5只行X线观察骨折愈合情况。处死家兔取患处组织标本，采用实时荧光定量PCR方法测定家兔骨组织中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA的含量，对所得数据进行统计学分析。结果：实时荧光定量PCR检测结果显示，实验组家兔第3、10周患处骨组织标本中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA表达均高于对照组，差异有统计学意义。结论：独正杆接骨膏外用可在骨折愈合早期促进骨组织中BMPR-1A、BMPR-1B mRNA的表达，同时可以维持晚期的表达量，延缓衰减趋势，促进骨折愈合。

独正杆接骨膏；骨折；愈合；家兔

独正杆接骨膏(鄂药制字Z20110140)是湖北民族学院附属民大医院治疗四肢骨折、跌打损伤、筋骨疼痛等多种骨伤疾病的自制膏剂，具有活血化瘀、接骨疗伤、通络止痛等功效。临床应用40多年来，其疗效确切、副作用小、廉价方便，治愈大量骨折及筋伤患者，在恩施州及周边地区具有较高的社会知名度。早在 1978 年该药就获得了全国卫生医药科技成果奖，此后部分学者对其部分药效机制、制剂工艺等方面进行了一些探索[1]。本研究旨在前人研究的基础上，探讨独正杆接骨膏外用对家兔骨折愈合过程中骨形态发生蛋白受体1 A(BMPR-1 A)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR-1B) mRNA表达的影响，分析其促进骨折愈合的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通成年日本大耳白兔30只，5～8月龄，平均体质量(2.0±0.5) kg/只，雌雄各半，购于湖北省实验动物研究中心(许可证号SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 实验药物

独正杆接骨膏由湖北民族学院附属民大医院制剂室生产(鄂药制字Z20110140，生产批号20100406)。

1.3 主要实验试剂

TRIZOL试剂(Invitrogen公司，批号15596-018)，cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas公司，批号#K1622)；SYBR Green/Flouresceinq PCR Master Mix(2X)(Fermentas公司，批号#K0242)；Ex TaqTM(TAKARA公司，批号DRR100 A)；DL2000 DNA Marker(TAKARA公司，批号D502 A)；引物合成(南京金斯瑞生物技术有限公司)。

1.4 主要实验仪器及设备

实时荧光定量PCR仪(ABI公司，型号Viia7)，分光光度计(上海舜宇恒科学仪器有限公司，型号752)，电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表有限公司，型号HW-SY11-K P2)，水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY300)，紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY02S)，电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号DHG 9203 A)，PH计(德国Metter-Toledo GmbH公司，型号LP115)，PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，型号EDC-810)。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分组 动物适应性饲养1周，术前禁食8 h。固定于兔架，腹腔注射麻醉，无菌条件下在桡骨前内侧中下1/3交界处纵行依次切开皮肤、浅筋膜、深筋膜约3 cm，钝性分离肌肉充分暴露桡骨，用不锈钢锯造成左侧桡骨中段3 mm的横行骨缺损。生理盐水冲洗伤口，皮肤消毒后逐层缝合，无菌纱布包扎，自由饮食、一般饲料、分笼饲养，术后3 d每天给予青霉素钠40万单位预防感染，肌肉注射每天1次[2-4]。按随机数字表法将造模成功后的30只家兔分成实验组和对照组各15只。

1.5.2 干预方法 实验组家兔每只按照5 g/kg的标准[5]将独正杆接骨膏均匀地涂抹在无菌纱布块上，并将纱布块覆盖切口上下5 cm左右的范围，采用夹板外固定，每2 d换药1次；对照组仅用碘伏常规消毒后普通无菌纱布块包扎，夹板固定。

1.5.3 标本取材及处理 分别于给药后第3、6、10周，每批每组随机抽取5只，行X线摄片观察骨折愈合情况后处死动物，无菌条件下以患处为中心，两端各取长约1 cm骨组织为标本，液氮保存。

1.5.4 PCR法检测BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表达水平 取液氮中保存的新鲜冰冻骨组织，质量约为100 mg研成粉末，采用Invitrogen公司TRIZOL试剂，按照说明书提取动物组织中总RNA，分光光度计测定RNA浓度。表1显示，参照cDNA第一链合成试剂盒说明书逆转录成cDNA。基因参考序列信息用Primer premier 5.0软件设计引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，以兔β-actin 作为内参。反应体系：依次加入上游引物(10 μmmol/L)×0.5 μL，下游引物(10 μmol)×0.5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)×μL 2，Ex Taq×0.25 μL，10×Ex Taq E buffer×2.5 μL，cDNA×1μL，加双蒸水至25，反应条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s；30 cycles，72 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。2%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA有无降解，取2 μLRNA溶液加1 μL上样，缓冲液混匀，样品加入样品孔，接通电源80 V电压电泳30 min，紫外灯下观察结果并照相扫描，将结果存入电脑进行数据分析。Real time Q-PCR检测：cDNA做10倍稀释。反应体系：cDNA(10×稀释)×4，上游引物(100 μmol/L)×0.4，下游引物(100 μmol/L)×0.4，H2O×5.2，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)× 10，反应条件： 50℃2 min 1个循环，95℃10 min，随后40个循环，95℃30 s，60℃30 s。对实验数据采用2-ΔΔct法进行计算。

表1 BMPR-1 A/BMPR-1B及Rabbit β-actin引物序列表

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况及X线片观察结果

术后第1天各组实验家兔能在笼中自如活动，正常进食及饮水。术后1周实验组家兔伤口红肿情况逐渐消退、无渗液；对照组组织红肿未见明显改善，无渗液，呈一期愈合，提示独正杆接骨膏外用在骨折愈合过程中具有促进创伤愈合的作用。

图1显示，术后3周2组家兔骨折患处均可见到的骨缺损，实验组可见云雾状阴影；术后6周2组均可见到骨痂形成，实验组骨缺损被骨痂填满且周围有大量外骨痂形成，对照组骨缺损处可见低密度骨痂填充，无外骨痂；第10周实验组骨缺损消失、骨皮质重建、骨干外形已恢复、骨髓腔已通，对照组骨缺损模糊，有少量外骨痂，髓腔未通。

图1 2组家兔左侧桡骨骨折处X线影像注：第一行依次为对照组3、6、10周，第二行依次为实验组3、6、10周

2.2 BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表达水平检测结果

表2图2、3显示，与对照组比较，实验组第3、10周家兔骨组织标本中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA的表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。第6周家兔骨组织标本中BMPR-1 A、BMPR-1BmRNA的表达与对照组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。

表2 2组实验动物各时间点BMPR-1AmRNA、BMPR-1BmRNA表达量

注：与对照组比较:*P<0.05

图2 不同时间点家兔骨折患处骨组织中BMPR-1AmRNA RT-PCR电泳结果注：泳道1：DL2000;泳道2-4：对照组3、6、10周；泳道5-7：实验组3、6、10周

图3 不同时间点家兔骨折患处骨组织中BMPR-1BmRNA RT-PCR电泳结果注：泳道1-3：对照组3、6、10周；泳道4-6：实验组3、6、10周;泳道7：DL2000

3 讨论

骨折愈合是骨折断端间的组织修复反应，是成骨细胞、破骨细胞及其他多种细胞和细胞因子参与的复杂过程。研究认为，骨形态发生蛋白(BMPs)为骨折愈合的启动因子，被公认为是目前最强的骨诱导分化因子。BMPs并不直接作用于靶基因，而是通过BMPs受体、信号途径和靶细胞基因组成的一个较为完整的信号系统，并发挥成骨诱导作用[6]。BMPs诱导成骨的机理主要是先与骨形态发生蛋白受体(BMPR)结合，BMPR分为I型、Ⅱ型受体，主要介导细胞内BMP信号的传导。其过程为BMP首先与II型受体和I型受体结合，I型受体磷酸化细胞内Smad蛋白，在细胞内Smad1、5、8能被I型受体激活后形成异聚体，与共同介质型Smad蛋白(Co-Smads)形成复合体，进入细胞核并与转录活化物或阻遏物形成复合物，调节靶基因转录，实现BMP信号由细胞外经细胞质向细胞核内靶基因的传递过程，然后再通过下游核心结合因子α1(Cbfα1)、成骨细胞特异性转录因子Osterix、远端缺失基因5(Dlx5)、同源域基因c8(Hoxc8)和肌肉片段同源盒2(Msx2)等正向转录调控因子，与相应的OB特异蛋白ALP、骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)等基因启动子连接，促进细胞向成骨方向分化，其中I型受体包括BMPR1A、BMPR1B，决定了信号传递的特异性[7]。BMPR 是 BMP 信号通路的重要环节，当BMP受体表达受到抑制时就会在一定程度上阻断BMP的信号通路，从而抑制细胞的生长分化[8]。有研究表明，在胚胎早期软骨雏形形成过程中 BMPR-1B 表达增加，随后在软骨膜内成骨时其表达迅速下降，而此时BMPR-1 A表达增加，提示BMPR-1B在软骨雏形形成过程中发挥重要作用，BMPR-1 A则主要参与骨的进一步生长发育[9-10]。

独正杆接骨膏由独正杆、刺五加、刺老苞3味土家族药物调和蜂蜜配制而成，主治跌打损伤、筋骨疼痛、闭合性骨折等多种病症[1]。方中独正杆性凉、味辛甘，具有活血散瘀、消肿止痛之功。刺五加[11]性温、味辛，功能祛风湿、补肝肾、强筋骨；刺老苞[12]性平、味苦，有小毒，功能祛风除湿、散瘀消肿、止血止痛，三药合用共奏接骨疗伤、活血化瘀、通络止痛之功[13]。作为一个优秀的民族医药制剂，独正杆接骨膏临床用于治疗脚踝部闭合性骨折疗效显著，同时对于急性软组织损伤、类风湿关节炎、膝骨关节炎等疾病具有良好的治疗效果[1]。前期研究结果表明，独正杆接骨膏外敷给药可对多项骨折愈合相关因子产生影响，如促进BMP-2、BMP-7、BMP-9、Smad1/5基因的表达，抑制Smad-6基因的表达[14-17]。

本实验结果显示，实验组家兔第3周骨组织中BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA表达量明显高于同期对照组的表达量，提示在骨折愈合早期过程中接骨膏可促进该受体的表达，加速介导细胞内BMP信号的传导过程，促进骨折愈合；而实验组第6周的表达水平与对照组相当，提示在骨折愈合中期独正杆接骨膏可能通过其他信号途径加速骨折的愈合，有待进一步研究；实验组第10周的表达水平显著高于对照组同期水平，提示接骨膏在骨折晚期运用可维持BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA的表达量，延缓衰减趋势，促进骨折的全面愈合。据此可以推测，独正杆接骨膏促进BMPR-1 A、BMPR-1B mRNA在患处骨组织中的表达可能是其良好疗效的作用机制之一。

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EffectofExternalApplicationofDuzhengJieguPasteontheExpressionofBMPR-1AandBMPR-1BmRNADuringFractureHealinginRabbits

HUANG Qiong1,XIANG Yang

(MedicalCollegeofHubeiInstituteforNationalities,Hubei,Enshi445000,China)

Objective: To investigate the effect of expression of BMPR-1B mRNA and BMPR-1A in the healing process of Duzheng Jiegu Paste on rabbit fracture, and to analyze the mechanism of promoting fracture healing. Methods: 30 rabbits were randomly divided into experimental group and control group, with 15 rabbits in each group. The experimental group in the affected area with Duzheng Jiegu Paste and small splint fixation, The control group without of drugs, only after routine disinfection of small splint fixation. On 3rd and 6, 10 weeks after the treatment, respectively, each group of 5 randomly selected, x-ray observation of fracture healing. Death affected area from the tumor specimens of rabbits, rabbit bone tissue was determined by real-time fluorescent quantitative PCR method in the BMPR-1A and BMPR-1B mRNA content, statistical analysis of the data. Results: Real time fluorescent quantitative PCR showed that the expression of rabbits of BMPR-1A and BMPR-1B mRNA were higher than those in the control group in the experimental group third and tenth weeks, the affected area of bone tissue specimens, the difference was statistically significant. Conclusion: Duzheng Jiegu Paste can also promote fracture healing in the early expression of BMPR-1A and BMPR-1BmRNA in bone tissue, it can maintain the expression of late, slow attenuation trend, promote fracture healing.

Duzhenggan Jiegu Paste; Fracture; Heal; Rabbits

R285.5

B

1006-3250(2017)10-1391-03

国家自然科学基金资助项目(81360570)-土家族药接骨膏对骨折愈合过程中BMP/VEGF表达调控的机理研究

黄 琼(1975-)，女(土家族)，湖北恩施人，副教授，医学博士，从事中医基础理论与土家族验方开发应用研究。

2017-04-06