食品添加剂ε—聚赖氨酸的发酵培养基优化

吴晨奇++徐良++司文会

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种由25-30个L-赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基连接而成的多肽。由于它具有抑菌谱广、安全性能高、热稳定性好等优点，使它成为了目前最具潜力的生物防腐剂。ε-PL已在美国、日本和韩国等地被广泛使用，而我国也已经逐渐把ε-PL作为食品添加剂使用。此外，ε-PL还可用作基因载体、可降解性材料和高吸水材料等。因此，ε-PL具有广阔的应用前景。

本实验通过正交试验方法对ε-PL的发酵培养基进行了优化，提高了发酵产量，为今后的研究提供一些依据。

材料与方法

材料与仪器。白色链霉菌（Streptomyces albulus）FQQ-5，本实验室诱变筛选保藏；甲基橙、酵母粉、葡萄糖、硫酸铵、MgSO4 ·7H2O、K2HPO4 、KH2PO4（分析纯），购于国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨（化学纯），购于阿拉丁试剂（上海）有限公司。

紫外-可见光分光光度计（UV-2450 ），日本岛津企业管理（中国）有限公司；灭菌烘箱（UNE500），德国MEMMERT公司；超净台（SW-CJ-2FD），苏州净化设备有限公司；摇床（TS-2102），上海天呈科技有限公司；实验室常规仪器。

实验方法。

（1）培养基配制

种子和发酵培养基为（g/L）：葡萄糖（50） 、酵母粉（5）、（NH4）2SO4（10）、MgSO4 ·7H2O（0.5）、K2HPO4（0.8）、KH2PO4（1.36）、FeSO4 ·7H2O（0.03）、ZnSO4·7H2O（0.04），pH 6.8，121 ℃灭菌 20 min。

（2）培养方法

①种子培养

250 mL锥形瓶中装50 mL种子培养基，接入一环孢子，200 r/mim，30 ℃培养24 h。

②摇瓶发酵培养

250 mL锥形瓶中装50 mL发酵培养基，按10%接种量接入种子液，200 r/mim，30 ℃培养72 h。

（3）指标的测定

ε-PL产量测定方法参照Itzhaki F R方法。

（4）发酵培养基优化

①发酵培养基的单因素实验

本实验选择了葡萄糖、酵母粉和硫酸铵这三种对发酵影响较大的成分，分别考察不同浓度对FQQ-5发酵产ε-PL的影响。其中，选择最佳的葡萄糖浓度时，葡萄糖浓度（g/L）设为20、30、40、50、60，其他同发酵培养基；选择最佳的酵母粉浓度时，酵母粉浓度（g/L）设为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5，其他同发酵培养基；选择最佳的硫酸铵浓度时，硫酸铵浓度（g/L）设为4、6、8、10、12，其他同发酵培养基。

②发酵培养基优化的正交实验

根据单因素的试验结果，选用葡萄糖、酵母粉及硫酸铵为考察因素，采用正交试验方法，设计三因素三水平的正交实验，其正交试验设计表见表1。

（5）数据处理方法 所有实验做3个平行，Excel进行实验数据误差分析。

结果与分析

葡萄糖浓度对ε-PL产量的影响。实验表明，当葡萄糖浓度低于40 g/L时，ε-PL产量不断增加，并达到最大的1.503 g/L，继续加大葡萄糖的浓度，ε-PL产量反而降低，这可能是由于过多的葡萄糖容易在发酵过程中引起“葡萄糖效应”，从而影响菌体生长和代谢产物的形成。所以本实验选择最佳的葡萄糖浓度为40 g/L。

酵母粉浓度对ε-PL产量的影响。实验表明，随酵母粉浓度的增加，ε-PL产量也随之增加； 当酵母粉浓度达到7.5 g/L时，ε-PL产量达到最大的1.552 g/L； 而继续加大酵母粉浓度时，ε-PL产量开始下降，这可能是由于酵母粉成分复杂，后期底物消耗不完，会诱导产生一些酶降解白色链霉菌菌丝体，故在本实验的考察范围内酵母粉的最佳浓度为7.5 g/L。

硫酸铵浓度对ε-PL产量的影响。实验表明，当硫酸铵浓度为6 g/L时，ε-PL产量达到最大的1.514 g/L，当继续加大硫酸铵浓度时，ε-PL產量开始降低，这说明太多的硫酸铵并不利于ε-PL的形成，因此，确定硫酸铵的最佳浓度为6 g/L。

正交实验确定各培养基成分用量。根据单因素实验的结果，采用正交试验对葡萄糖、酵母粉、硫酸铵进行优化，实验结果如表1所示。

由表1可知，对ε-PL产量的影响排序为：葡萄糖>酵母粉>硫酸铵。最后选择的最优组合为：葡萄糖35g/L、酵母粉7.5g/L、硫酸铵6g/L，在此条件下，FQQ-5的ε-PL产量达1.853 g/L，比优化前的产量提高了19.4%。

通过本实验，对ε-PL的培养基进行了优化，优化后的培养基组分为（g/L）：葡萄糖（35）、酵母粉（7.5）、（NH4）2SO4（6）、MgSO4 ·7H2O（0.5）、K2HPO4（0.8）、KH2PO4 （1.36）、FeSO4·7H2O（0.03）、ZnSO4·7H2O （0.04），在此条件下，FQQ-5的ε-PL产量达1.853 g/L，比优化前的产量提高了19.4%。今后将在5 L发酵罐上采用此优化培养基进行发酵工艺的研究，以期进一步提高发酵产量，为ε-PL的工业化生产提供一定依据。

基金项目：江苏省高校自然科学研究面上项目（16KJD55002）。endprint