干酪乳杆菌胞外多糖的单糖组成分析

王宗莹

立题背景

干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受有机体的防御机制，其中包括胃液中低pH值、口腔中的酶和小肠的胆汁酸等。所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到促进人体消化吸收、调节肠内菌群平衡等作用 。

目前已知乳酸菌发挥主要生理功能特性的机理，除了主要代谢产物（如乳酸等）改善肠道内环境外，乳酸菌的次生代谢产物如细菌素、SOD、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）等也具有重要的作用。乳酸菌胞外多糖（LAB EPS）即是这类细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液或夹膜多糖。自20世纪40年代成功开发出由肠明串珠菌发酵产生右旋糖酐以来，新的微生物胞外多糖的研究与开发在世界范围内已成为研究的热点。而乳酸菌胞外多糖因具有理论和实际应用价值已经引起了许多学者的兴趣。许多乳酸菌是历史悠久的工业生产菌，乳酸菌EPS不仅对乳制品的质构和风味具有重要影响，而且有可能成为食品级多糖的一个极好的来源而广泛应用于各种食品的增稠、乳化、稳定、胶凝及保湿。

干酪乳杆菌

干酪乳杆菌的生长特性。干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）属于乳杆菌属（Lactobacillus），是革兰氏阳性菌，不产芽孢，不运动，无鞭毛，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶；最适生长温度为37℃；菌体两端呈方形，长短不一，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。干酪乳杆菌存在于人的肠道、口腔内含物和大便及阴道中，也常常出现在牛奶和饲料、乳制品、面团、干酪和垃圾中。

干酪乳杆菌的生理功能。（1）抗菌作用。研究表明，干酪乳杆菌不仅对很多细菌有拮抗作用，有的菌株还可以抑制酵母及霉菌的生长。Nemcova等报道L.paracasei可显著降低刚断奶幼猪体内梭菌属和肠杆菌的数量；雷虹等值乳酸菌发酵泡菜液中分离得到的干酪乳杆菌HD1-7对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、沙门氏菌等很多致病菌均有抑制作用。

（2）免疫作用。研究表明，干酪乳桿菌可增强宿主对微生物病原体的非特异性抵抗力，加快肠道内病原体的清除，能够改善肠道菌群紊乱和肠道通透性增强等，从而防止食物过敏和急性腹泻，使抗低密度氧化脂抗体和CD4T-淋巴细胞增加，粒细胞的噬菌作用明显增强，对宿主进行免疫调节，防止肿瘤的产生。

多糖及其结构

多糖。多糖属于碳水化合物的一种，是由10个以上单糖分子通过糖苷键缩合而成的高聚物。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般无甜味，不溶于水，不能形成结晶，无变旋现象和还原性。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解过程中，往往产生一系列的中间产物，最终完全水解得到单糖。

目前在多糖一级结构的分析中大多采用化学方法与物理方法相结合，可基本阐明某一多糖的一级结构的大致特征。而目前用于多糖高级结构分析的方法主要是物理方法， 诸如核磁共振、X-射线纤维衍射、电子衍射等。综上所述，多糖的一级结构本身就很复杂。由于多糖结构的微观不均一性， 或分子量分散， 或是结构键中有缺陷，使多糖的一级结构分析难以得出完全正确的结构式。

多糖结构。多糖的结构层次与蛋白质基本相似，分为一级、二级、三级和四级。其中，一级结构变化较大，研究较为成熟，到目前为止，已经建立的分析方法主要有物理法、化学法和生物法，例如，高碘酸氧化、甲基化反应、Smit11降解、酸水解、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）、气相色谱法（GC） 、核磁共振谱法（NMR）、红外光谱法（IR）、酶化学方法等[7]；二、三、四级结构又合称为高级结构（又称高级构象），在很大程度上取决于一级结构，对其研究较为困难，目前多糖的立体结构研究一般靠 2D-NMR及X-衍射法，除了常见的这几类技术手段外，多处于探索阶段。除此之外， 多糖的活性还与溶解度、分子量、粘度等理化性质有关。在研究多糖的构效关系时， 常用到多糖的分子修饰， 对多糖进行化学修饰，如硫酸化、化学降解、烷基化、脱硫酸化、乙酰化、酶降解等等， 有助于深入探讨其构效关系。

多糖的结构常因单糖构型、糖基化方式、轻基取代情祝、分支度、相邻单糖基糖链位置的不同而不同，其结构的多变性使其成为生物体内重要的信息载体。多糖结构描述通常包括单糖组成、单糖构型、分子量范围、糖昔键构型、重复单元、连接位点，甚至是空间构型。

对于分子量较大的多糖，对其结构研究大多停留在一级结构层面，现目前往往不能得到令人满意的结果，因此，探索更为有力的研究手段成为今后发展的重要方向。

多糖结构的描述包括： ①多糖的分子量范围；②多糖的单糖组分；③单糖的连接点类型；④单糖和糖苷键的构型；⑤重复单位。

干酪乳杆菌胞外多糖

胞外多糖 （Exopolysaccharides ， EPS ）是由细菌和微型藻类在生长过程中分泌到细胞外的长链多糖，广泛产生于细菌与少数酵母菌及丝状真菌中。在自然环境中，EPS通常具有保护微生物细胞的作用，如受噬菌体侵染，避免细胞干燥脱水，还可稳定渗透压，参与细胞信息传递和细胞构成等。EPS常常以荚膜多糖和薪多糖两种形式存在，但对于微生物来说，主要是指小与细胞表面永久粘附的黏多糖[8]。

乳酸菌能分泌多糖于细胞外，形成荚膜多糖粘附于细胞表面或以粘质多糖形式存在于细胞周边培养基中，其形成有利于改善产品的质地和黏度。目前报道的产胞外多糖的主要的乳杆菌菌株有德氏保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、开菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和清酒乳杆菌等。

产生胞外多糖的条件不一定是菌株的最佳生长条件。一些研究表明，在不同于干乳杆菌最适生长条件下接种，可以促进胞外多糖产量增加。GASSEM M A等认为，较低的接种温度将导致活菌数量缓慢增加，有利于延长稳定期和对数期，从而有利于胞外多糖的形成。实验表明干酪乳杆菌在葡萄糖添加量为4.68%，pH值为3.2，发酵时间为27.51h的条件下能够形成较高产量的胞外多糖聚合物。endprint

干酪乳杆菌胞外多糖结构的鉴定

多糖结构的鉴定一般采用化学方法和波谱分析。化学方法主要包括酸解、甲基化、Smith降解过碘酸氧化等。波谱分析包括红外吸收光谱、质谱、核磁共振氢谱（1H NMR ）、二维核磁共振（2D NMR） 、核磁共振碳谱（13C NMR ）和X射线衍射法等。

对EPS进行结构分析时多采用以下几种方法：经过完全的或部分水解后，将单糖或寡糖乙酰化衍生化，通过HPLC或GC-MS方法检测单糖组成；采用甲基化法测定糖连接位置，通过各甲基化物之间的比例，还可以推断出糖链重复单元中各种单糖的数目；糖并键构型的确定方法有酶解法、分子旋光差法、红外法、核磁共振法等，其中目前最常用的是核磁共振法；糖的氧环确定方法有13C NMR法、1H NMR法、甲醇解法、红外法、Smith降解法等。

研究内容

测定胞外多糖的总糖含量和蛋白质含量，重点分析多糖中单糖组成及其比例。主要利用紫外分光光度法，凝胶色譜法和气相色谱质谱分析法。

材料与设备

干酪乳杆菌胞外多糖。

干酪乳杆菌胞外多糖样品由实验室提供。

试剂。

单糖标准品（葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖），苯酚，浓硫酸，酪蛋白，考马斯亮蓝，乙醇，磷酸，三氟乙酸，甲醇，硼氢化钠，乙酸酐，吡啶，氯仿。

仪器与设备。

电热恒温培养箱DHP-9082 上海一恒科学仪器有限公司

DELTA 320 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

分析天平XP205 瑞士梅特勒-托利多公司

紫外可见分光光度计UV-2550 日本岛津公司

气相色谱-质谱联用仪（Agillent 6890-5973色谱系统，色谱柱DB-5 （60m×0.25mm×0.20μm））。

凝胶色谱柱及检测器（色谱柱为Agilent PL aquagel-OH mixed柱（300mm×7.5mm，i.d.8?m），示差折光检测器）。

实验方法

单糖的含量总量测定。

（1）标准曲线的制作。准确称取葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6及0.4ml，各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

（2）样品的测定。吸取2 ml的样品液，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。

总糖%=测得总糖含量/样品总量×100%

蛋白质含量的测定。

（1）酪蛋白标准溶液的制备与保存

取0.1mg/ml的酪蛋白标准溶液，4.0℃～5.0℃冰箱中保存。

（2）考马斯亮蓝G-250溶液的制备

精密称取考马斯亮蓝G-250 100.00mg加入95%乙醇50ml，再加入85%磷酸100ml，然后用蒸馏水定容至1000ml。最终试剂为含0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇，8.5%磷酸，置于棕色瓶中备用。

（3）样品的制备

精确称取干酪乳杆菌胞外多糖100.00mg加蒸馏水溶解定容至100ml，即为1mg/ml样品溶液。

（4）标准曲线的制备

分别精密吸取标准蛋白质溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0ml于10ml试管中，各管加水调整至1ml，加入已配置好的考马斯亮蓝G-250溶液5ml，混匀，放置10min，以空白试剂参比，于595nm处测定其吸光度。并记录且绘制标准曲线。

（5）样品中蛋白质含量的测定

取样品溶液各1ml，同时做三个重复，以空白试剂为参比，按上述标准曲线的测定法，分别测定他们吸光度值，计算样品中蛋白质的含量。

凝胶色谱分析多糖中单糖构成。

（1）干酪乳杆菌胞外多糖的水解。精确称取1份干酪乳杆菌胞外多糖20. 0mg于试剂瓶中，加入2.0 mol/ L TFA 5ml，封管，置于110 ℃烘箱内进行水解，水解时间分别为8h。冷却至室温，将水解液低于50℃减压蒸干，然后加入甲醇蒸干，备用。

（2）色谱条件。色谱柱为Agilent PL aquagel-OH mixed柱（300mm×7.5mm，i .d . 8?m）， 柱温30℃；流动相为水，流速1mL/min；进样量50?L；示差折光检测器，检测温度35℃。

GC-MS法分析多糖的单糖组成。

（1）样品衍生化。取多糖水解样品，溶于2 mL蒸馏水中，加入硼氢化钠，还原反应2 h，蒸干；将还原后的糖醇置于110 ℃烘箱中加热，加入乙酸酐和吡啶，100 ℃反应1 h，蒸干。将乙酰化的产物用4 mL氯仿溶解后过滤，上机。

（2）色谱条件。程序升温条件： 初始温度200℃ ； 以25℃/min，升温至250℃，保持11min。色谱柱： DB-5 （60m×0.25mm×0.20μm）Agillent 6890-5973气相色谱-质谱联用仪；进样口：250℃；离子源： EI；四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；载气：He；进样模式：splitless ；流速：1ml/min；电离方式：EI，70eV；质量扫描范围：50～550 amu

结果与讨论

单糖含量的测定。endprint

（1）葡萄糖标准曲线的制备

（2）样品结果测定及分析

测得样品OD值为0.998

该干酪乳杆菌胞外多糖总糖百分含量

=（184.296÷2÷1000）/0.1×100%

= 92.148%

由实验数据可知 该干酪乳杆菌中含有糖类总量为92.148%，符合标准要求。对其杂项本文并未作出细致分析，将留待下次试验解决。但通过该实验可以说明，该干酪乳杆菌胞外多糖中不仅仅含有糖类物质，同时也含有其他待确认物質。

蛋白质含量的测定。

（1）酪蛋白标准曲线的制备

得其线性回归方程式A= 0.0081C-0.0739 R2=0.9962 相关系数r=0.9980 表明蛋白质在10?g/ml～100 ?g/ml 范围内很好地符合朗伯-比尔（Lamber-Beer）定律。

（2）样品蛋白质含量测定结果

按上述蛋白质含量测定方法，同时做三个重复试验，经测定吸光度值分别为0.459 ，0.458 ，0.441，计算得干酪乳杆菌胞外多糖中蛋白质含量分别为6.58% ，6.57%，6.37%，平均含量为6.51%。

凝胶色谱分析多糖中单糖构成。

凝胶色谱图谱如图3所示。

通过分析发现，该多糖样品中主要有5种单糖组分。但在5.0-8.0ml范围内时，峰型较宽且出峰较缓，分析结果不十分明显，预计分析为在此情况下仍有组分未被分解出来。但由于实验时间条件有限，故仅作此粗略分析。

GC-MS法分析多糖的单糖组成。

干酪乳杆菌胞外多糖的单糖构成气质图谱如下图。图4为单糖混标图谱，图5为样品图谱。

通过GC-MS分析结果可知：干酪乳杆菌胞外多糖主要由阿拉伯糖，木糖，甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖等6种单糖组成。当然不排除该糖样品中还包括有其他糖类物质，因为实验条件及时间有限，对于气相色谱的实验要求也非常高，故而该实验不能一次完成更多糖样品的测定。根据文献，在乳酸菌胞外多糖结构中最常见的有甘露糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖7种单糖。分析如下：

由上表可知，在本实验中测得，干酪乳杆菌胞外多糖中主要含有六种单糖，分别是阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，鼠李糖和半乳糖。其中以甘露糖，半乳糖和葡萄糖的含量较多。六种单糖的含量比为葡萄糖：甘露糖：鼠李糖：半乳糖：阿拉伯糖：木糖=1.0000：3.4249：0.0670：1.6030：0.6326：0.2150。

经分析，干酪乳杆菌胞外多糖冻干样品中总糖含量为92.148%（以葡萄糖计），蛋白质含量为6.51%，该多糖由阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6种单糖组成，六种单糖的含量比依次为葡萄糖：甘露糖：鼠李糖：半乳糖：阿拉伯糖：木糖=1.0000：3.4249：0.0670：1.6030：0.6326：0.2150.

本实验仅对干酪乳杆菌胞外多糖的一级结构进行了分析，且分析并不完善，有待进一步研究，接下来可以探索通过阴离子液相色谱，气相色谱，薄层分析等方法对干酪乳杆菌胞外多糖进行结构分析，以增强对干酪乳杆菌胞外多糖的了解，并通过此对乳酸菌胞外多糖的结构开始进行进一步的探索。endprint