微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养条件研究

刘云++王琳+贾保军

微生物絮凝剂是利用微生物技术，通过生物发酵、抽提、精制而得到的一种具有生物分解性和较高安全性的新型、高效、无毒的廉价水处理剂，目前国内外研究者已经筛选到了许多能够产生絮凝剂的微生物。产生絮凝剂菌分布广泛，在土壤与污水中分布较多，且种类繁多。目前对微生物絮凝剂的研究还多局限于实验室水平的菌种筛选及特性研究。 获得高活性微生物絮凝剂产生菌， 研究其培养条件， 降低生产成本是后续研究和开发应用的基础。

本文通过对污水处理厂活性污泥的分离筛选，得到4株具有较高絮凝活性的菌株，并分析其最优的培养条件，为高活性微生物絮凝剂的产生及其实际应用提供了基础数据。

材料与方法

菌种的来源。本研究以某污水处理厂的活性污泥为对象，筛选得到4株具有絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌，并对其最佳培养条件进行优化实验。

菌种的分离与筛选。（1）筛选培养基（GC液体培养基）：葡萄糖20g，酵母浸膏0.5g，脲0.5g，K2HP04 5g，KH2P04 2g，NaCl 0.1g， （NH4）2S04 0.2g，水l000mL，pH =8.0，121℃灭菌20min；（2）分离与筛选 采用倒平板法和分离划线法进行菌种的分离。对培养2-3d的培养皿进行观察，根据形态和颜色的差异，分离得到较纯的微生物菌株。将分离得到的菌株接种到筛选培养基中，于32±0.5℃，150r/min培养72h，对发酵液进行初步絮凝活性的检测，得到絮凝活性较高的菌株。

絮凝活性的测定。在50mL具塞比色试管中加入2mLl%CaCl2溶液，0.2g高嶺土，定容，调节pH值为9，再加入3mL培养液摇匀，静置10min，吸取上清夜于比色皿中，于紫外可见分光光度计在660nm处测定上清夜的吸光度（OD660），以不加发酵液的培养基为对照。通过计算确定其絮凝活性。

絮凝率（%）=（A-B）/A×100%

式中：A——对照在660nm处的吸光度

B—样品在660nm处的吸光度

培养条件的优化。对筛选出来的四株菌株， 分别改变培养条件， 如培养基的成分及初始pH值、培养温度、摇床转速等因素，测定培养液的絮凝活性， 以确定微生物产絮凝剂的最优培养条件。

结果与分析

分离筛选结果。通过菌种的分离，并将纯化后的菌株经初筛和复筛后共获得4株具有较强絮凝活性的菌株，初步确定并将其编号为1#细菌，2#放线菌，3#霉菌，4#酵母菌。

影响微生物生长及其絮凝活性的条件分析。（1）碳源浓度对菌株的影响。碳源能够供给微生物生长、繁殖和活动的能量，并且是微生物细胞合成的主要物质构成。本实验选择葡萄糖作为微生物培养的碳源，将筛选出的四株菌株转到优化培养基中，通过改变葡萄糖的浓度，控制在150r/min ，32℃条件下培养72h，测定4株菌株的絮凝率，分析培养基中最佳的碳源浓度。其浓度不同对产絮凝剂的影响如表1所示。

由图1可以看出，在以葡萄糖为主要碳源，经相同培养条件，测定1#细菌、2#放线菌、3#霉菌及4#酵母菌的絮凝率最高分别为81.27%、85.62%、82.17%和87.55% ，而且葡萄糖浓度对絮凝活性的有较大的影响，碳源浓度过低，则不能为微生物提供足够的生长能量，但是浓度过高不仅对絮凝率没有很大的提高，反而会由于碳氮比过高而造成营养比例失衡，影响微生物的生长。通过实验结果分析，本实验的1#细菌、2#放线菌、3#霉菌及4#酵母菌的碳源浓度分别为7g/L、10g/L、9g/L、15g/L。

（2）（NH4）2SO4的浓度对絮凝率的影响。在微生物培养的过程中，氮源是构成微生物体的蛋白质、核酸等化合物的重要原材料，对微生物的生长发育有着重要作用。有研究表明，氮源中的酵母膏和（NH4）2SO4过量或者不足对微生物生长及其絮凝剂的产生影响最大。因此控制最佳碳源浓度条件下，培养基中（NH4）2SO4的浓度对微生物的影响，结果如图2所示。

由图2可以看出，四株菌在不同的（NH4）2SO4浓度下，絮凝活性有较大幅度的变化，并且由图可以看出1#细菌、2#放线菌、3#霉菌及4#酵母菌在（NH4）2SO4浓度分别为0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L条件下，絮凝率分别可达86.47%、82.76%、89.29%、73.57%，其中3#霉菌的絮凝率最高，可达89%以上。

（3）培养液的初始pH值的影响。pH值通过改变生物体的表面电荷，影响生物酶的活性和有机化合物的离子化程度，与微生物的代谢活动有密切的影响。在最优葡萄糖浓度、（NH4）2SO4浓度，控制不同pH值，于32℃、150r/min条件下培养72h，测定培养液的絮凝活性，分析pH值对微生物生长的影响。实验结果见图3。

由图3可以看出，当pH位置在6～8范围内时，1#细菌、2#放线菌和3#霉菌微生物的培养发酵液有较高絮凝活性，当pH大于8时，絮凝活性迅速下降。而4#酵母菌最佳pH值在7左右，絮凝率随pH的变化不明显，因此具有有较好的酸碱稳定度。

（4）摇床转速的影响。在最优葡萄糖浓度、（NH4）2SO4浓度以及最佳pH值条件下，控制不同转速于32℃进行振荡培养72h，并测定相应培养液的絮凝活性，实验结果如图4所示。

摇床转速的大小直接影响微生物生长所需的通氧量。转速过低，不能为菌体的生长提供足够的氧气而影响其生长。而转速过高，导致通气量大，微生物的生长繁殖过快，及早进入衰亡阶段，絮凝剂的产量降低。因此在实际应用中要充分考虑合适的通氧量，保证菌体的生长和絮凝剂的合成。 由图4实验结果可知，摇床转速控制在160r/min时，4株菌株都具有交到的絮凝率，最高可达90%以上。

（5）培养温度对絮凝剂产生菌的影响。微生物的培养温度是微生物生长和存活的重要因素之一。微生物絮凝剂的主要成分为蛋白质、核酸、糖类等，其中蛋白质、核酸等对温度具有较高的敏感性，过高或过低的温度会对机体产生严重影响，因此，需要分析不同的微生物对温度的适应范围，通过控制最佳的葡萄糖浓度、（NH4）2SO4浓度、pH值以及最佳的转速，设定不同的培养温度，振荡培养72h，测定培养液对高岭土悬液的絮凝活性，结果见图5。

由图5可知，培养温度34℃时4#酵母菌的絮凝率为92.21%，1#细菌和2#放线菌在30℃时，其絮凝率最高，达到87.58%和82.58%， 3#霉菌在32℃的絮凝率达83.45%，远高于其它温度时的絮凝率，因此本实验所用的4株菌株的最佳培养温度应控制在30℃～34℃范围内。

本文通过菌种的筛分得到4株具有较高絮凝活性的菌株，确定为1#细菌、2#放线菌、3#霉菌、4#酵母菌。实验结果表明，1#细菌、2#放线菌、3#霉菌、4#酵母菌的最佳培养条件分别为：葡萄糖浓度为7g/L， 10 g/L， 15 g/L， 9 g/L，（NH4）2SO4的浓度分别为0.26 g/L、0.3 g/L、0.36 g/L、0.24 g/L，培养液的初始pH值为8、7、7、7.5，最佳摇床转速控制在160r/min，最佳培养温度为30℃、30℃、34℃、32℃。并且在其各自最佳培养条件下，其絮凝活性最高可达85%～90%以上。

基金项目：河南省教育厅自然科学基金项目（2011A610008），河南理工大学博士基金项目（648206）。

作者简介：

贾保军（1974-），男，河南新乡人，博士，副教授，研究方向：水污染控制。endprint