德国牧羊犬发情期间唾液-血清孕酮相关性分析

潘彩霞,熊 前,李川武,叶俊华

(公安部南昌警犬基地, 江西 南昌 330100)

德国牧羊犬发情期间唾液-血清孕酮相关性分析

潘彩霞,熊 前,李川武*,叶俊华*

(公安部南昌警犬基地, 江西 南昌 330100)

血清孕酮(P4)检测可用于犬的发情鉴定及配种时间的确定,但血液样本采集难度较大,若操作不当还会给犬造成心理及生理上的伤害.与血液采集相比,唾液采集操作简便、无侵入性且不易对犬造成伤害,因此若能通过采集唾液代替血液测定犬生殖激素,对工作犬的繁育工作具有极大的现实意义.本实验旨在进一步测定德国牧羊犬发情期间唾液-血清P4的相关性,从而探讨唾液代替血液进行测定的可能性.实验选择处于发情前期、3~5岁的5只德国牧羊犬,测定发情期间唾液与血清中P4的含量并进行规律分析.结果表明:唾液中P4浓度在犬发情期间从0.08 ng/mL逐渐升高,到第15天达到0.47 ng/mL,与血液P4含量变化具有较高的相关性,在0.01水平上显著相关,相关系数平均达到0.890.通过拟合曲线分析,发现在y=0.0761ln(x)+0.1513曲线上有较高拟合度(R2=0.945 5).由此可见,德国牧羊犬发情期间的唾液P4与血清P4具有良好的相关性,有望通过唾液代替血液测定犬发情期间生殖激素含量及分析变化规律.

唾液;血清;孕酮;相关性

母犬为一年单次或双次发情,每次发情持续时间为9~11 d,适宜配种时间通常为4~6 d,一旦错过最佳配种时间,母犬受胎率和窝产仔数将受到影响.因此有效的母犬发情鉴定及最佳配种时间的确定在日常生产中非常重要.国内外研究表明,母犬出现发情表现、卵细胞的发育、排卵等生理变化都是体内一系列生殖激素变化导致的[1].如果母犬某些激素达到一定水平就会引起机体的相应变化,若激素水平异常,则出现发情异常.因此可通过对母犬体内生殖激素变化的测定进行母犬发情鉴定,进一步确定配种时间,从而避免因母犬隐性发情或发情症状不明显导致错过发情期.激素测定的常用手段是静脉采血[2-3],但多次采血会对母犬机体造成一定创伤且易感染,同时采血时较大的应激也会造成母犬激素分泌不稳定,不利于母犬受孕.近年来,有研究表明某些药物及类固醇激素在唾液和血液中的浓度之间有着一定相关性[4-5].唾液检测具有样本收集方便且不具侵入性、不会给测试者造成压力等优点,因此用唾液代替血液对受试者的体况进行测定,既是受试者的期望也是国内外学者不断尝试的方向.

常用的动物发情鉴定激素有促黄体素(LH)、雌二醇(E2)及孕酮(P4).犬的LH释放是脉冲式的,且持续释放时间仅有2~3 d,这给LH的检测带来一定困难[6];另一方面,E2在犬排卵前达到峰值后浓度快速下降,不利于准确检测和分析[3].而P4在母犬发情期间增长稳定且释放持续时间长,有利于激素的观测和分析.在上述前提下,本实验开展了德国牧羊犬发情期间唾液中P4浓度的检测并研究其与血液P4浓度的相关性,以期通过测定唾液P4来鉴定母犬发情、确定配种时间.

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验犬为公安部南昌警犬基地正常繁育使用的种用德国牧羊犬,从犬群中选出3~5岁、膘情中等、体况相似、生殖机能正常的中青年母犬.从中随机选择正处于发情前期的5只母犬,并以其发情周期中出现发情表征(阴道开始出现血性分泌物)的当天作为实验第1天开始采集样本.

1.2 血液样本采集及处理 当母犬出现发情征兆,即阴道开始出现血性分泌物时采血,每天采血1次,连续采集15 d.采血时间为08∶00-09∶00,前肢静脉采血3 mL,3 600 r/min离心10 min,取血清至于密封管中,编号并保存于-80℃超低温冰箱中待检测.

1.3 唾液样本采集及处理

1.3.1 柠檬酸棉签制备 配制5%的柠檬酸溶液,将棉签浸没于该溶液中,静置3~5 min,使棉签被柠檬酸溶液充分浸透,然后取出棉签置于60℃烘箱中3 h[7].

1.3.2 唾液采集 采集时,让犬咬住硬物,保持口腔张开状态,用柠檬酸处理过的棉签擦拭犬的舌头及口腔其他内部位置,刺激犬的唾液自然流出,用一次性平皿采集流出的唾液,整个采集过程控制在30~60 s.将采集的唾液移至离心管,12 000 r/min离心10 min,取上清液至密封管中,编号并保存于-80℃超低温冰箱中待检测.

1.4 激素测定 将处理好的唾液及血清样本从-80℃超低温冰箱中取出,放置4℃冰箱中使其溶解.用Beckman AccessTM全自动化学发光检测系统检测样本中的P4含量.

1.5 统计分析 唾液及血清中P4的浓度值均用平均值±标准差表示,差异显著性检验(t-检验,P<0.01为显著差异)及相关性分析均采用SPSS统计软件分析.

2 结果与分析

从图1可以看出,发情前期,犬血清中的P4浓度一般在0~1.5 ng/mL,在9~11 d血清中的P4浓度达到2 ng/mL以上,随后快速上升,这和国内外很多学者的研究结果保持一致[3,8].从唾液P4浓度变化可以看出,在发情前期,唾液中P4浓度一直维持在0.08~0.15 ng/mL,在9~11 d唾液中孕酮浓度显著升高,达到0.2 ng/mL以上,随后快速上升.唾液P4浓度的变化趋势和血清P4浓度的变化趋势相同,有较高的相关性.

图1 发情期间唾液P4和血清P4浓度变化曲线

图2 发情期间唾液P4与血清P4浓度的拟合曲线

将5只实验犬15 d的唾液和血清中P4浓度数值(150组数据)在X-Y上做散点图并进行曲线拟合(图2),在 y=0.0761ln(x)+0.1513曲线上唾液P4和血清P4有较好的相关性(R2=0.945 5).

由表1可知,唾液P4和血液P4的相关系数(R)为0.784~0.956,且均在0.01水平(双侧)上显著相关,唾液P4和血液P4浓度之间的相关系数平均为0.890.以上结果表明,在犬的发情期间母犬血清P4与唾液P4之间有较好的相关性.

3 讨 论

与血液中只有1%~15%具备生物活性的激素含量相比,所有能够进入唾液的激素都具备生物活性,因而唾液中激素的检测价值远大于血液,加之唾液激素水平不受唾液流动率或唾液酶的影响,故而唾液是极佳的诊断标本,具备广阔的研究及应用前景.

表1 发情期间血清P4与唾液P4浓度关系

近年来,随着学界对唾液与血液指标检测的相关性研究日渐深入,指标相关性的研究内容已经从葡萄糖含量[9]、尿素氮及尿酸浓度[10]等逐步扩展到类固醇激素.Bolaji[11]和Shoko等[12]发现了女性生理周期唾液P4和血液P4之间的相关性.从本实验结果可以看出,唾液中测得的P4浓度变化与血清中P4变化基本保持一致.前人研究表明[3,8],母犬在发情前期,血清P4水平非常低(0~1 ng/mL),卵巢上有卵泡,在LH增长之前,血清P4含量就开始上升,而当LH达峰值时,P4含量会达到1.5~2.5 ng/mL;当P4达到这一水平,2 d后便开始排卵,因此一般血清P4达到1.5~2.5 ng/mL后2~6 d内为最佳配种时间.本实验测得的血清P4变化与以往研究结果保持一致,且唾液P4浓度在犬发情期间从0.08 ng/mL逐渐升高,到第15天含量达到0.47 ng/mL,与血液P4含量变化具有较高的相关性,在0.01水平上显著相关,相关系数平均达到0.890.进行拟合曲线分析,发现在y=0.0761ln(x)+0.151 3曲线上有较高拟合度(R2=0.945 5).本实验结果说明,德国牧羊犬发情期间的唾液P4与血清P4具有良好的相关性,有望将唾液代替血液对母犬的激素变化进行测定,以此对母犬进行发情鉴定并判断最佳配种时间.

本实验得到的结果虽较为满意,但仍存在许多不足.首先,本实验只随机选取了5只正处发情的母犬,样本量较小,与真正应用于临床实践的要求仍存较大差距.其次,本实验仅选择德国牧羊犬这一种品种作为研究对象,无法证实用唾液P4测定代替血清P4测定在其他犬种的应用是否具有可行性.最后,犬的年龄、体重、身体状况等的不同都会影响到唾液P4与血液P4的相关性.综上所述,将唾液P4检测运用到母犬发情鉴定及最佳配种时间的确定,仍存在较多不确定因素,需进一步探究.

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S829.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-11-055

2017-07-17;

2017-08-17

国家重点研发计划项目(2016YFD0501008);江西省警犬良种繁育与行为科学重点实验室开放课题基金;江西省重点研发计划项目(20161BBG70041)

潘彩霞(1992-),女,江西乐平人,硕士,实习研究员,主要从事动物繁殖与育种工作,E-mail:412932303@qq.com

* 通讯作者:叶俊华,E-mail:yjh575757@163.com;李川武,E-mail:lechwu201@163.com