白虎加人参汤对糖尿病模型大鼠TRPA1通道基因表达的影响

刘影哲，林洁，潘祥宾

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

白虎加人参汤对糖尿病模型大鼠TRPA1通道基因表达的影响

刘影哲1，林洁1，潘祥宾2*

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：探讨白虎加人参汤对糖尿病大鼠氧化应激状态下血清丙二醛及背神经根TRPA1mRNA表达的影响。方法：腹腔注射链脲佐菌素的方法制备糖尿病大鼠模型，实验分为白虎加人参汤组、α-硫辛酸组、模型对照组及空白对照组。ELISA法测定大鼠血清MDA含量，RT-PCR法检测TRPA1mRNA表达水平。结果：白虎加人参汤和α-硫辛酸组大鼠血清MDA水平与模型对照组比较均有所下降(P<0.01)，但两组之间比较无统计学差异(P>0.05)。白虎加人参汤组、α-硫辛酸组Drg中TRPA1mRNA的表达均下降，但中药组下调作用更明显，具有统计学差异(P<0.05)。结论：白虎加人参汤能降低糖尿病模型大鼠血清MDA的含量，并下调Drg中TRPA1mRNA的表达,对糖尿病神经病变有一定的防治作用。

白虎加人参汤；糖尿病；MDA；TRPA1

随着糖尿病发病率的持续增高，其并发症导致的致残率及致死率增高成为了医患关注的重点。糖尿病周围神经病变(DPN)引起的冷、麻、热、痛等感觉异常症状严重影响了患者的生活质量。瞬时感受器电位基因超家族(TRP)的发现，为感觉异常疾病，特别是本病的研究提供了广阔的空间，其调控的冷、热、痛感觉异常即为本病的发病特征。本实验研究白虎加人参汤对糖尿病大鼠背神经根中TRPA1mRNA表达的影响，为DPN的临床治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

黑龙江中医药大学实验动物中心购买45只清洁级健康雄性SD大鼠，体质量(220±10)g，许可证号：SCXK(黑)2013-004。

1.1.2 主要药物及试剂

白虎加人参汤由石膏、知母、甘草、粳米、人参组成(均购自黑龙江中医药大学附属第一医院)；α-硫辛酸注射液(重庆药友制药有限公司)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；丙二醛(MDA)试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；Real-time PCR 试剂盒(TaKaRa公司 code DRR420A)。

TRPA1-F引物序列(5′to3′)GCGTCTTGGTTTTGCAGCTC;TRPA1-R,ACCGTCCTTTTGCCAGTTCC;βactin-F,ACTCTGTGTGGATTGGTGGC;βactin-R,AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC，以上引物均购于TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备与实验分组

45只SD大鼠随机选取10只作为空白对照组，余下禁食12 h后腹腔注射STZ 50 mg/kg，72 h后给予尾静脉采血，检测血糖数值。将血糖≥16.7 mmol/L的31只模型成功大鼠随机分成模型对照组、白虎加人参汤组和α-硫辛酸组。分别给予中药9.38 g/(kg·d)及α-硫辛酸20 mg/(kg·d)灌服8周；模型对照组和空白对照组给予同体积生理盐水。

1.2.2 观察指标

1)一般情况观察；2)测定丙二醛(MDA)；3)检测大鼠背根神经节TRPA1mRNA的基因表达。

1.2.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般状态比较

空白对照组大鼠一般状况较好,模型对照组逐渐出现精神萎靡，并有个别大鼠出现足部溃烂及眼球变白等现象。白虎加人参汤组和α-硫辛酸组大鼠状态介于两组之间。实验周期内，空白组大鼠死亡1只；模型组死亡3只，白虎加人参汤组死亡2只，α-硫辛酸组死亡3只。

2.2 血清MDA含量比较

表1可见，与空白对照组比较，各组大鼠血清MDA水平明显升高，具有统计学差异(P<0.05)；白虎加人参汤组和α-硫辛酸组与模型对照组比较，大鼠血清MDA水平均有下降(P<0.01)，两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。

表1 血清MDA水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，□P<0.01；与α-硫辛酸组比较，■P>0.05。

2.3 大鼠背根神经节TRPA1mRNA基因表达情况

结果见表2与图1。模型组、白虎加人参汤组和α-硫辛酸组与空白组相比较，TRPA1mRNA的表达均升高(P<0.01)；与模型对照组比较，白虎加人参汤组和α-硫辛酸组TRPA1mRNA的表达均下降(P<0.05)；白虎加人参汤组TRPA1mRNA表达水平下降更明显，与α-硫辛酸组比较具有统计学差异(P<0.05)。

图1 TRPA1mRNA电泳图注：Lane 1、2、3为模型组电泳带；Lane 4、5、6为空白组电泳带；Lane 7、8、9为硫辛酸组电泳带；Lane 10、11、12为白虎加人参汤组电泳带。

组别nTRPA1mRNA空白对照组31．01±0．01模型对照组32．07±0．52∗白虎加人参汤组31．46±0．23∗□■α-硫辛酸组31．55±0．45∗□

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，□P<0.05；与α-硫辛酸组比较，■P<0.05。

3 讨论

糖尿病周围神经病变(DPN)的发病率已达到60～90%[1]。除了微循环障碍和血管损伤学说，大量证据表明神经元功能的特殊改变是DPN的主要机制，而且在糖尿病初期即已存在，只是其临床表现不明显，易被人们所忽视，当出现凉、麻、痛等表现时，患者神经损伤已经很严重,严重影响了患者的生活质量。因此，早期防治本病,延缓病情发展至关重要[2]。白虎加人参汤方出自《伤寒论》第222条“若渴欲饮水，口干舌燥者，白虎加人参汤主之”，是治疗糖尿病初期的代表方剂之一。目前针对白虎加人参汤的实验研究多从血糖[3]、血脂等指标入手，阐述其保护胰岛功能和减轻胰岛素抵抗的作用机制，对其并发症的治疗机制多从抗氧化应激入手进行深入阐述，并证实了其可提高糖尿病大鼠的痛阈值，提高坐骨神经的传导速度，同时具有改善神经纤维和髓鞘变性[4]等作用。

多项糖尿病神经病变的研究已证实，TRP离子通道对于调控冷、热、痛感觉异常起着关键的作用。TRPA1通道可被低温及氧自由基等因素激活，研究已证实在温度低于17℃的时候TRPA1通道被激活[5]，产生冷痛觉及神经源性疼痛和超敏反应。有研究发现,TRPA1确实参与了炎症或神经损伤后的冷痛感觉[6-7]。在糖尿病神经病变和化疗药物引起的外周神经病变等研究中已经发现TRPA1通道的介导作用尤为明确[8-9]。Serena[10]指出,冷刺激介导的疼痛仅与TRPA1相关，并且明确了在氧化应激状态下可发挥作用。随着糖尿病并发症的加重，机体的寒热状态一直处于动态演变，白虎加人参汤可对机体的寒热进行调控，与TRP离子通道的作用机制异曲同工，故我们从TRP离子通道入手，探讨白虎加人参汤治疗糖尿病及其并发症的作用机制，系对中医药异病同治，未病防变理论的深入的阐述。

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[2] 王宏伟，冷锦红.糖尿病周围神经病变的中医药治疗研究进展[J].中医药信息,2017,34(4):124-128.

[3] 赖洁梅,朱贱香.白虎加人参汤对 2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响[J].中药新药与临床药理,2014,25(6):683-687.

[4] 王璞,王聿成.白虎加人参汤干预糖代谢及糖尿病并发症的实验研究进展[J].中医药导报,2013,19(10)：67-68.

[5] Jaquemard D,Schenker T,Trueb B,et al. An ankyrin-like protein withtransmembrane domains is specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts[J].J Biol Chem,1999,274(11):7325-7333.

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[7] Obata K,Katsura H,Mizushima T,et al.Trpa1 Induced in Sensory Neurons Contributes to Cold Hyperalgesia after Inflammation and Nerve Inury[J].J Clin Invest,2005,115(9):2393-2401.

[8] 明露,陈艳芬.TRPA1在疼痛感受的研究进展[J].广东药学院学报,2015,31(1):122-125.

[9] 冯昌盛,黄宇光.疼痛离子通道TRPA1研究进展[J].华西医学,2011,26(1):146-148.

[10] Serena Materazzi,Camilla Fusi,Silvia Benemei.TRPA1 and TRPV4 mediate paclitaxel-induced peripheral neuropathy in mice via a glutathione-sensitive mechanism[J].Eur J Physiol,2012,463:561-569.

TRPA1mRNAExpressioninDMRatsTreatedwithBaihuRenshenDecoction

LIU Ying-zhe1, LIN Jie1, PAN Xiang-bin2*

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective: To investigate the impact of Baihu Renshen decoction on the expressions of MDA and TRPA1mRNA under oxidative stress in DM(diabetes mellitus) rats. Methods: DM models were established by injecting STZ. DM rats were randomly divided into the Chinese medication group, the western medication group, the model group and the blank control group. The Chinese medication group was treated with Baihu Renshen decoction, and the western medication group was given alpha lipoic acid. The content of MDA was determined with ELISA method, and the expressions of TRPA1mRNA was detected by RT-PCR. Results: The MDA levels of the medication groups were both significantly decreased compared to those of the model group(P<0.01), but there was no statistical difference between the two medication groups(P>0.05). The expression of TRPA1mRNA in the medication groups were decreased, of which the Chinese medication group was more obvious(P<0.05). Conclusion: Baihu Renshen decoction can reduce the content of MDA in DM rats, and decrease the expression of TRPA1mRNA, it has some protective effect on diabetic neuropathy.

Baihu Renshen decoction; DM; MDA;TRPA1

R285.5

A

1002-2406(2017)06-0038-03

黑龙江省教育厅基金项目(No.12521508)；黑龙江省自然科学基金项目(No．H201314)

刘影哲(1977-)，女，医学博士，副教授，主要研究方向：中医药防治糖尿病分子机制的研究。

潘祥宾*(1976-),男，副主任医师，主要研究方向：中医药防治糖尿病作用机制研究。

2017-03-10

修回日期：2017-04-11