玉米品种抗粗缩病人工接种鉴定方法研究

杜琳琳+吕建颖+曹晓燕+饶鸣帅+施文娟+兰莹+孙枫+程兆榜+孟庆长+袁建华+周益军+周彤

摘要：为建立科学有效的玉米品种抗玉米粗缩病人工接种鉴定方法，分别研究了玉米接种苗龄、接种强度及接种时间3个因素对鉴定效果的影响。结果显示，玉米接种苗龄在芽鞘期、2叶1心期和4叶1心期接种无显著差异；在有效接种强度为3头/苗条件下，鉴定效果优于1～2头/苗处理；接种12～48 h条件下，鉴定效果优于6 h处理。由此构建了玉米粗缩病人工接种鉴定方法：在玉米芽鞘期至4叶1心期接种，接种时间12～48 h，有效接种强度3头/苗。在此条件下对玉米品种苏951进行接种鉴定，鉴定结果与重病区田间鉴定无显著性差异，表明所建立的人工接种鉴定方法能客观地反映玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平。

关键词：玉米粗缩病；水稻黑条矮缩病毒；人工接种；抗性鉴定

中图分类号： S435.131.4+9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0093-02

通信作者：周彤，博士，研究员，主要从事植物抗病性研究。E-mail：zhoutong@jaas.ac.cn。玉米粗缩病（maize rough dwarf disease，MRDD）是由灰飞虱[Laodelphax striatellus （Fallén）]（SBPH）以持久性不经卵方式传播的一种恶性病毒病[1]，通常表现为叶色深绿，植株严重矮化，节间变短、变粗，叶背出现白色蜡状突起，籽粒较少或者不结籽粒[2]。引起MRDD的病毒目前有3种：Rice black streaked dwarf virus（RBSDV）、Mal de Rio Cuarto virus（MRCV）和Maize rough dwarf virus（MRDV），我国玉米粗缩病病原为水稻黑条矮缩病毒（RBSDV），除侵染玉米外，还可以侵染水稻、小麦、大麦等禾本科植物[3]。该病害于1954年传入我国以来，20世纪70年代和90年代该病曾在我国大范围长时间流行，至今已扩展到河北、陕西、山东、江苏、湖北、辽宁等十余省市[4]。近年来，随着气候环境变化和玉米种植面积的扩大，玉米粗缩病的发生进一步趋重，已上升为玉米生产上最为严重的病毒病害[5]，据统计，仅2008年山东省发病面积就达 1 110.82万hm2，其中重病田块病株率达50%以上，而春播、套种玉米病株率可高达80%以上，山东省因为粗缩病造成 1.667万hm2 玉米绝产[6]，严重影响了玉米的安全生产。

目前生产上采用的治虫防病方法只能作为一种应急防治策略，而选育和应用抗病品种无疑是一种更为经濟环保的防治策略。目前，玉米粗缩病抗性鉴定主要依靠重病区田间鉴定和人工接种鉴定[7]。田间鉴定易受田间灰飞虱数量、灰飞虱带毒率等环境因素的影响，鉴定结果重演性与准确性较差，往往需要多年、多点的重复试验，极大地延缓了抗粗缩病育种的进程[8]。而现有人工接种鉴定方法均直接以接虫数量作为接种强度的指标，忽略了仅有携带RBSDV的灰飞虱才能传毒这一因素。为此，本课题组引入灰飞虱有效接种量（有效接种量=接种虫数×带毒率）的概念，并从接种苗龄、接种强度和接种时间3个方面研究玉米粗缩病人工接种鉴定的最佳条件，以期为玉米抗玉米粗缩病的品种选育提供切实可行的鉴定技术。

1材料与方法

1.1玉米材料和接种体的准备

以感病玉米品种苏951为接种对象。于江苏省重病区采集植株矮缩、叶色浓绿、分蘖略有增多、心叶有缺刻、叶片质厚等表现出小麦绿矮病典型症状的小麦植株[9]，参照周彤等的方法[10]将灰飞虱在RBSDV毒源上饲喂获毒，之后移入育有武育粳3号秧苗的烧杯中饲养13 d，度过循回期，每批次饲毒虫中随机取100头，参照周彤等的方法检测灰飞虱带毒率，并测算有效接种虫量（有效接种虫量=接种虫量×带毒率）[11]。

1.2人工接种鉴定最佳条件筛选

1.2.1接种时间对鉴定的影响接种时间设置6、12、24、48 h 4个处理，重复3次。将感病玉米品种苏951播种于装有蛭石与营养土1 ∶1混配土的500 mL烧杯中，每杯播4株苗，用40目网纱制成防虫纱罩。待玉米苗长至2叶1心时进行接种鉴定，接种前2 d淘汰病弱苗，挑选生长一致的幼苗 25～30株进行接种，有效接种强度2头/苗。每天赶虫2次，以确保被鉴定的玉米苗均匀获毒。接种2 d后清除全部灰飞虱，将玉米苗移栽至大田。30 d后开始调查发病情况，每7 d调查1次，连续调查3次。参照玉米粗缩病典型症状[2]调查病害发生情况，计算发病率。

1.2.2接种强度对鉴定的影响有效接种虫量设置1、2、3头/苗3个处理，重复3次。播种方式同“1.2.1”节的方法。待玉米苗长至2叶1心期进行接种鉴定，接种时间为2 d，接种后处理及调查方法同“1.2.1”节的方法。

1.2.3玉米接种苗龄对鉴定的影响接种苗龄设置芽鞘期、2叶1心期和4叶1心期3个处理，重复3次。播种方式同“1.2.1”节的方法，按有效接种强度2头/苗进行接种，接种时间为2 d，接种后处理及调查方法同“1.2.1”节的方法。

1.3人工接种鉴定与重病区田间鉴定效果的比较

选择大丰稻麦原种场和丰县欢口镇沙庄村常年重病区作为鉴定圃，两地分别于2012年5月下旬和2014年6月上旬播种玉米品种苏951。于鉴定圃灰飞虱一代成虫峰期调查灰飞虱虫量并采集500头高龄若虫，随机取100头检测带毒率[10]，于田间第1次发病高峰期调查发病情况，每7 d重复调查1次，计算发病率。玉米整个生长期间不喷洒任何杀虫剂和抗病毒剂。

1.4数据统计分析

数据采用SPASS 16.0软件处理，Duncans新复极差法进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1人工接种鉴定方法的最佳条件筛选

各批次获得接种用灰飞虱经ELISA检测，带毒率在 15%～42%之间，转换为有效接种虫量后将获毒灰飞虱用于人工接种鉴定。病毒在介体体内的接种时间、接种强度、水稻接种苗龄3个因素对鉴定效果的影响如表1所示。endprint

接种时间：随着接种时间的增加玉米粗缩病的发病率不断升高。接种6、12、24、48 h后，玉米粗缩病的发病率分别为60.97%、85.63%、86.87%、90.17%，接种12、24、48 h处理显著高于6 h处理（P<0.05），且这3个处理间差异不显著，表明玉米粗缩病人工接种鉴定适宜接种时间为12～48 h。

接种强度：当有效接虫量为1、2、3头/苗时，玉米粗缩病发病率分别为87.73%、87.75%、98.67%。其中有效接种虫量3头/苗的发病率显著高于另外2个处理（P<0.05），但有效接种虫量每苗为1头和2头2个处理间差异不显著，表明玉米粗缩病人工接种鉴定适宜接种虫量为3头/苗。

接种苗龄：在玉米芽鞘期、2叶1心、4叶1心期接种，玉米粗缩病发病率分别为83.95%、87.65%、80.64%。3个处理间发病率差异不显著（P>0.05），表明适宜玉米粗缩病人工接种鉴定的接种苗龄为芽鞘期至4叶1心期。

2.2人工接种鉴定与重病区田间鉴定效果的比较

大丰稻麦原种场和丰县欢口镇沙庄村一代灰飞虱成虫峰期总虫量分别为1 303.5万、390万头/hm2，带毒率分别为200%和3.00%，有效接种虫量分别为26.1万、11.7万头/hm2。玉米品种苏951在2个重病区田间鉴定的结果分别为100%和93.50%。人工接种鉴定与重病区田间鉴定结果间无显著差异，表明本研究建立的人工接种鉴定方法能够模拟重病区田间鉴定效果，它的抗性评价结果可靠。

3讨论

20世纪以来，国内很多学者开展了玉米抗玉米粗缩病材料的筛选工作，但鉴定结果发现抗病材料较少。目前生产上急需建立科学、准确的抗性鉴定方法。田间自然传毒鉴定方法虽方便快捷，但受环境条件、灰飞風发生及迁飞数量等因素制约，难以保证鉴定效果的准确性和重演性。如张海燕等研究表明登海3622、邦玉358、金海5号和农大108表现为感病[12]，而王延玲等得到的结果为抗病[13]，杨兴飞等和薛林等均鉴定为高抗[14-15]。因此，人工接种鉴定无疑是更为科学和可靠的方法。针对玉米粗缩病的人工接种鉴定方法，前人已做了许多尝试。但在接种强度的指标方面，往往直接使用接虫数量，忽略了只有携带RBSDV的灰飞虱才能侵染玉米使其发病这一因素。这使不同研究结果间出现了较大差异，影响了抗性鉴定效果，如邸垫平等的网箱集团接种试验结果表明，约1.7头/苗时发病率达92.31%～100%[16]；而Wang等和张爱红等分别以10头/苗和5头/苗接种，发病率分别为35.00%和27.67%[17-18]。本研究通过ELISA方法检测灰飞虱带毒率，并引入灰飞虱有效接种虫量作为接种强度的量化指标。为验证建立的人工接种鉴定方法的可靠性，我们对重病区抗性鉴定圃大丰稻麦原种场和丰县欢口镇沙庄村进行了虫量和带毒率的调查，以1 hm2 67 500株苗折算，其有效接种虫量折算分别为3.86头/苗和1.73头/苗，这与人工接种鉴定的接种强度基本一致。

在稻—麦或玉—麦轮作区，来自小麦的第1代携带RBSDV的灰飞虱是玉米粗缩病的主要侵染源[19-21]，这一田间传毒规律启发我们把小麦作为病毒来源。本世纪初之前RBSDV侵染小麦后常表现隐症，但随着全球气候变暖导致小麦生育期延长，以及田间病害发生程度的日趋严重，田间开始出现小麦绿矮病危害[22]，便于大量获得饲毒灰飞虱用病毒样本，有利于提高抗性鉴定的效率和规模。此外，本试验以小麦绿矮病株为初始毒源饲喂灰飞虱，是在最大程度地模拟田间实际的基础上建立的人工鉴定方法。以抗感水平已知的玉米品种苏951为研究对象，采用多年多地重病区田间鉴定和人工接种鉴定方法进行分析，二者结果一致，表明本研究构建的人工接种鉴定方法能客观地反映玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平，希望为玉米品种的抗性评价、抗玉米粗缩病品种的选育等提供切实可行的鉴定技术。

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