循环内皮细胞在恩度联合NP方案治疗非小细胞肺癌中的变化及意义

杨宏　韩震　何敏　张翠英

【摘要】 目的：探討肺癌患者恩度联合NP方案化疗前后外周血循环内皮细胞（CECs）以及活性循环内皮细胞（aCECs）的变化及其临床意义。方法：用流式细胞仪对2013年5月-2015年10月本院20例健康人（对照组）及68例肺癌患者（治疗组）治疗前后外周血CECs及aCECs进行检测。结果：对照组外周血CECs及aCECs的数量均低于治疗组，差异均有统计学意义（P<0.001）。恩度联合NP治疗后CECs及aCECs数目出现分层变化，其中临床获益（CR+PR）患者CECs及aCECs数目与治疗前比较，差异均有统计学意义（P<0.001）；临床进展（PD）患者CECs及aCECs数目与治疗前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；临床稳定（SD）患者CECs及aCECs数目变化分层、CECs数目变化与治疗前比较，差异均无统计学意义（P>0.05），aCECs数目与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：恩度通过对肿瘤血管生成的负性调节，提高了抗肿瘤效果并抑制肿瘤生长速度，CECs及aCECs的联合检测可能是恩度联合NP方案治疗肺癌的较好疗效预测指标。

【关键词】 恩度； 循环内皮细胞； 活化循环内皮细胞

The Changes and Significance of Circulating Endothelial Cells in Non-small Cell Lung Cancer Treatment of Endostar Combined with NP Regimen/YANG Hong，HAN Zhen，HE Min，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：023-026

【Abstract】 Objective：To discuss the changes of endothelial cells（CECs） in peripheral blood circulation（CECs） and the changes of the active circulating endothelial cells（aCECs） and its clinical significance in patients with lung cancer patients.Method：CECs and aCECs were detected in 20 healthy people （the control group）and 68 lung cancer patients（the treatment group）by flow cytometry before and after treatmnet from June 2013 to October 2015.Result：The number of CECs and aCECs in control group were significantly lower than those of the treatment group，the differences were statistically significant（P<0.001）. Endostar combined with NP after the treatment of CECs and the number of aCECs layered changes，the number of CECs and aCECs in patients with clinical benefit（CR+PR） were decreased than before treatment，the differences were statistically significant（P<0.001），there were no significant differences of the number of CECs and aCECs in patients with clinical progress（PD） before and after treatment（P>0.05）.The number of CECs and aCECs in patients with clinical stability（SD） was stratified，and there were no significant differences CECs before and after treatment（P>0.05），and the differences of aCECs number before and after treatment was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Endostar can improve anti-tumor therapeutic effect and inhibit tumor growth speed by negative regulation of tumor angiogenesis， the combined detection of CECs and aCECs may be a good predictor to evaluate the Endostar combined with NP chemotherapy in patients with lung cancer.

【Key words】 Endu； Circulating endothelial cells； Activated circulating endothelial cells

First-authors address：Inner Mongolia Peoples Hospital，Hohhot 010017，Chinaendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.007

非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer）是肺癌的特发病例，也是肺癌患者中占据比例较大的疾病类型，临床统计数据显示，其占肺癌总数的75%～85%，且诊断难度较大[1]。恩度（Endostar）是我国自主设计研发的抗新生血管生成疗法，治疗机制以建立足够的血管系统，从而为其生长提供氧气和营养为目标，对抑制血管生成和肿瘤生长具有遏制作用[2]。恩度联合化疗成为NSCLC一线治疗非小细胞肺癌的可行性方案[3]。但是恩度价格很高而且有一定的副反应，因此有必要寻找一种方法来预测其疗效，从而可以指导临床选择减少患者不必要的经济负担的方案，真正做到精准治疗。抗血管生成药物通过抑制VEGF-VEGFR途径来抑制血管内皮细胞特异性生长。是调节血管生成细胞因子、诱导血管新生和抑制肿瘤生长方面起着重要作用，国外学者研究发现它能在体内诱导血管新生、反映肿瘤血管生成及监测血管治疗药物疗效的标记物[4]。其中活化内皮细胞（activited Circulating endothelial cells，aCECs）更可以反映肿瘤的新生血管生成的活力[5]。本研究选用恩度联合NP方案治疗ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌，联合检测治疗前后患者血清CECs、aCECs水平的变化，分析和比较变化的意义，为临床决策提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年5月-2015年10月本院68例组织病理学或细胞学确诊的晚期非小细胞肺癌患者为治疗组，具体纳入标准：经病理学研究结果证实，确诊为晚期非小细胞肺癌患者；KPS评分：0～1分；无化疗禁忌证及抗血管生成药物禁忌证患者。其中男41例，女27例，年龄45～72岁，平均（59±14）岁；鳞癌25例，腺癌43例；Ⅲb期4例，Ⅳ期64例。另选取健康人20例作为对照组，纳入标准：（1）健康自愿者；（2）年龄20～70岁；（3）排除心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、内分泌系统疾病、免疫系统疾病、肿瘤的患者。其中男15例，女5例，年龄37～64岁，平均（52.0±13.5）岁。两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 治疗组为NP（长春瑞滨+顺铂）方案联合恩度，具体为：长春瑞滨25 mg/m2，第1、8天，静滴；顺铂25 mg/m2，第2～4天，静滴，并在化疗第1～14天静脉滴注恩度15 mg，每21天为1个疗程，至少完成2周期上述方案方可评价疗效，至多不超过6个周期。

1.2.2 仪器与试剂 流式细胞仪（FACS AriaTM Cell Sorter）由美国Becton Dickinson公司生产；Beckman-Coulter公司生产的CD45-PE-Cy5抗体（PN：Im2653U）、CD146-PE抗体（Cat：550315）、CD106-FI TC抗体（Cat：551146），天津灏洋生物有限公司的淋巴细胞分离液（Cat：LTS1077），溶血剂为0.83%的氯化铵溶液，PBS液由本实验室自行配制。

1.2.3 检测方法 采用荧光抗体标记，流式细胞仪检测。（1）标本采集：健康对照组在体检中心体检时采血。NSCLC患者：在第一周期治疗前1 d和第二周期的第22天采血。两次取清晨静脉血，分别为1 mL静脉血和5 mL静脉血于EDTA抗凝管4 ℃冰箱保存血，6 h处理后并用流式细胞仪自动检测CECs和aCECs。（2）标本处理：应用细胞分离技萃取单个核细胞约1.5 mL，以3倍PBS液1300 r/min离心5 min，取细胞悬液100～200 μL备测；三种流式试管CD45-PE-Cy5、CD146-PE、CD106-FITC容积分别为2、10、10 μL同时加入50 μL备测细胞悬液，摇匀震荡，室温下避光15 min；再于三试剂内加入溶血剂500 μL，摇匀震荡，室温下避光10 min；完全溶血后在15 min内上流式细胞仪检测。（3）标本检测：检测前对设备性能进行质控，对光流路质量调控和荧光补偿的允许范围进行定性，严格散射光信号对单个核细胞群进行设门，标本获取设门内细胞>100 000个，再据以Li stmode文件对检测数据及其占比进行统计记录。

1.3 疗效评估标准 依据胸部CT、脑MR、骨扫描及腹部B超对比，2009年RECIST1.1版实体肿瘤疗效评定标准进行评估。按照RECIST标准评价疗效，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD）。CR：全部病灶消失，维持4周以上；PR：病灶缩小至少30%，维持4周以上；SD：介于部分缓解和进展之间；PD：病灶增加超过20%，或出现新病灶。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者治疗情况 治疗组68例患者中，可评价疗效为44例，均至少完成2周期恩度联合NP方案治疗，没有患者达到完全缓解（CR），9例患者部分缓解（PR），29例患者稳定（SD），6例患者病情进展（PD）。其余24例患者因各种原因未能完成治疗。

2.2 两组治疗前CECs及aCECs数量比较 治疗组68例晚期NSCLC患者化疗前CECs数目明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗组化疗前aCECs数目明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001）。对NSCLC患者进一步分层分析显示：治疗前鳞癌的CECs及aCECs数目分别为（2677.0±208.5）、（997.0±110.5）个/mL，与腺癌的（2705.0±204.3）、（890.0±103.2）个/mL比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。endprint

2.3 治疗组治疗前后CECs及aCECs数量比较 治疗组44例可评价疗效NSCLC患者中，化疗后外周血中CECs的数目较化疗前变化出现分层。其中CR+PR患者外周血CECs数目较治疗前降低，差异有统计学意义（P<0.001）；SD、PD患者外周血CECs数目与治疗前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后CR+PR、SD患者外周血aCECs数目均低于治疗前，差异均有统计学意义（P<0.001）；PD患者治疗前后比较，差异无统计学意义（P=0.545）。见表2。

3 讨论

抗血管生成药物通过抑制VEGF-VEGFR途径来抑制内皮细胞，在肿瘤生长中能加快结构、功能异常的肿瘤血管的形成，产生大量的肿瘤血管[6-7]。其中aCECs是由成熟CECs被激活后进入循环中转变而成，通常在肿瘤周围并参与形成新生血管。因为两者在肿瘤血管新生和肿瘤生长方面起着重要作用，所以笔者假设其数量变化可能反映血管生成的变化以及恩度的疗效。目前有研究认为其有可能为血管靶向药物的理想标记物[8-9]。其中活性CECs（aCECs）可以更好地反映肿瘤新生血管生成的活力。国内也有关于CECs在不同肿瘤中的相关研究[10-11]。

本研究联合检测恩度联合NP方案治疗晚期NSCLC前后的CECs及aCECs变化，并对健康人群（对照组）与NSCLC患者（治疗组）的CECs及aCECs进行比较和探讨。本研究结果显示，对照组CECs与aCECs的数量均低于治疗组，差异均有统计学意义（P<0.001），这与文献[12-13]报道结果一致。同时本研究中所有完成2周期恩度联合NP方案治疗的患者在治疗后的平均CECs与aCECs的数量比治疗前出现了不同情况的变化，经过分层后结果又有不同，其中CR+PR患者外周血CECs数目较治疗前降低，差异有统计学意义（P<0.001）；SD、PD患者外周血CECs数目与治疗前比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后CR+PR、SD患者外周血aCECs数目均低于治疗前，差异均有统计学意义（P<0.001）；PD患者治疗前后比较，差异无统计学意义（P=0.545）。文献[14]研究结果显示化疗造成CECs下降。

以内皮抑制素最为理想，它不仅抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移，使肿瘤细胞凋亡，而且不产生耐药，毒副作用轻[15-16]，NP+恩度方案联合热疗治疗晚期非小细胞肺癌是合理、安全、有效的一种可行性方案，而恩度联合放化疗同步治疗可以提高局部晚期非小细胞的局部控制和生存率，恩度联合顺铂局部灌注治疗晚期NSCLC合并胸腔积液具有一定的临床效果，不良反应较少，能提高部分患者的生活质量，其作用机制与抑制VEGF、HIF-1α表达水平有关[17-20]。在不同的研究中所检测的CEC亚群不同（活性或凋亡CEC），单纯给予化疗后诱发肿瘤的CECs重新释放，它增加了即刻的CECs的暂时升高，通过抗血管生成治疗克服这部分释放。本研究采用恩度联合NP方案治疗NSCLC，结果是有效的，患者CECs及aCECs数量在治疗后均出现下降。

综上所述，恩度通过对肿瘤血管生成的负性调节，提高了抗肿瘤效果并抑制肿瘤生长速度，CECs及aCECs的联合检测可能是恩度联合NP方案治疗肺癌的较好疗效预测指标。

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（收稿日期：2017-07-03） （本文编辑：康玥）endprint