6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2肾小管上皮细胞损伤的保护作用

陈燕玲*，罗 婷，吴秀香，凡 栋，李海洲，曾洪敏，康 毅，王晓玲，黄霜枝

（遵义医学院珠海校区病理生理学教研室，广东 珠海 519041）

6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2肾小管上皮细胞损伤的保护作用

陈燕玲*，罗 婷，吴秀香，凡 栋，李海洲，曾洪敏，康 毅，王晓玲，黄霜枝

（遵义医学院珠海校区病理生理学教研室，广东 珠海 519041）

目的探讨6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2肾小管上皮细胞（HK-2细胞）损伤的保护作用。方法采用丙酮醛诱导的HK-2细胞构建细胞损伤模型，并用6-姜酚进行干预。应用CCK-8法检测HK-2细胞的存活率；DAPI染色法检测HK-2细胞凋亡形态学变化。Western blot法检测活化的caspase-3蛋白表达。结果与对照组相比，模型组细胞存活率下降，差异有统计学意义（P＜0.05），并出现明显凋亡特征；而加入6-姜酚处理后，细胞存活率及活化的caspase-3蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论6-姜酚对丙酮醛诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用。

6-姜酚；丙酮醛；HK-2细胞

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病的一种主要并发症，其发病机制复杂，包括糖脂代谢紊乱、炎症反应、氧化应激、肾脏血流动力学异常等。近年来，研究发现蛋白质非酶糖基化终末产物（AGEs）是DN发生的重要原因。AGEs可通过改变肾小球基底膜结构，最终导致蛋白尿及肾小球硬化，加快DN的发展[1]。丙酮醛（methylglyoxal, MG）作为糖基化终末产物的前体，可以快速生成AGEs，从而引起系膜细胞及小管上皮细胞损伤[2]。

6-姜酚是由干姜提取出来的主要有效成分，研究发现其有抗炎、抗氧化、降压以及抗肿瘤等药理作用[3]。目前在临床上没有专门针对DN的特效药物，只能通过控制血糖、血压及改善微循环等措施，但疗效欠佳。因此，本研究旨在通过MG诱导HK-2细胞构建细胞损伤模型，研究6-姜酚对抗丙酮醛诱导的HK-2细胞的损伤作用，为临床治疗DN提供新的实验依据。现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

1.1.1 细胞株

由中山大学中山医学院病理生理学教研室提供。

1.1.2 药品与主要试剂

6-姜酚购自上海同田生物技术有限公司（纯度＞98%），丙酮醛购自上海源叶生物科技有限公司。细胞计数试剂盒CCK-8购于同仁化学研究所，活化的caspase-3抗体及β-actin抗体均购自Cell Signaling Technology。

1.2 主要方法

1.2.1 6-姜酚对HK-2细胞存活率的影响

取对数生长期细胞，以2×108/L的细胞密度接种于96孔板，每孔100 μL，分为对照组（Control）、MG（400 μmol/L）处理组、MG+6-姜酚（1，10，50，100，200 μmol/L）共处理组。每组设5个复孔，培养24 h。酶标仪测定450 nm处吸OD值，计算细胞存活率的方法：细胞存活率（%）=（处理组OD值-空白孔OD值）/（对照组OD值-空白孔OD值）×100%。以上实验重复3次。

1.2.2 6-姜酚对HK-2细胞凋亡的影响

实验分为对照组、MG处理组、MG+6-姜酚组以及6-姜酚组，取对数生长期细胞，按3×107/L的细胞密度均匀接种于6孔培养板内，经相应药物处理24h后，加入1μg/L DAPI试剂，室温避光孵育20 min后，荧光显微镜下随机选取10个不重复区拍照。

1.2.3 Western blot 法检测活化的caspase-3蛋白表达水平

HK-2细胞接种于100mm培养皿中，经相应药物处理24 h后，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解细胞，提取蛋白。每组蛋白上样量为50 μg，电泳：恒压80V 30 min，100V60 min。电转：恒流200mA 1h。5%脱脂奶粉封闭，加入caspase-3一抗，4℃摇床孵育过夜，加入二抗。β-actin作为内参。在暗室曝光、显影及定影后，使用ImageJ软件对条带进行灰度分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以“±s”表示，采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 6-姜酚对MG诱导的HK-2细胞存活率的影响

如图1所示，与对照组相比，MG处理后HK-2细胞细胞活力明显降低，而加入6-姜酚后，细胞活力明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 6-姜酚对MG诱导的HK-2细胞存活率的影响**P＜0.01与对照组相比（± s，n=5）

2.2 6-姜酚对MG诱导的HK-2细胞凋亡的影响

如图2所示，对照组细胞核染色均匀，核呈圆形；经MG处理后，部分HK-2细胞出现典型的凋亡特征，即细胞核固缩以及变得不规则，而加入6-姜酚处理后HK-2细胞凋亡细胞数目减少。

图2 6-姜酚的抗凋亡作用

2.3 6-姜酚对MG诱导的HK-2细胞活化caspase-3蛋白表达的影响

如图3所示，HK-2细胞经MG处理后，活化caspase-3蛋白的表达水平均明显增高，而加入6-姜酚处理后caspase-3蛋白表达水平明显降低。

图3 6-姜酚对MG诱导的HK-2细胞活化caspase-3蛋白表达的影响*P＜0.05与对照组相比（± s，n=3）

3 讨 论

糖尿病肾病（DN）是临床上最常见的糖尿病并发症，在欧洲约20～40%糖尿病患者最终发展为DN，这也是临床上患者进行透析治疗的首要原因[4]。DN的发病机制复杂，近年来研究发现糖基化终产物（AGEs）的前体丙酮醛的过度生成，导致糖尿病患者靶器官损伤，是糖尿病并发症发生发展的核心环节[2]。丙酮醛作为葡萄糖代谢的副产物，其水平在糖尿病患者中明显升高[5]。丙酮醛对肾小管上皮细胞有直接的损伤作用，这种损伤作用会加重糖尿病肾病的严重程度。

6-姜酚是从传统的药食两用植物干姜中提取出来的成分，具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎等广泛的药理学作用[3]。本研究显示，丙酮醛可以抑制HK-2细胞的存活率并诱导HK-2细胞发生凋亡，而6-姜酚可以对抗丙酮醛对HK-2细胞的毒性作用。本实验将为干姜在临床上的进一步应用提供实验依据。

[1] 李敏州,高彦彬,马鸣飞,朱智耀,邹大威,李 勤.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,22:344-349.

[2] Ramasamy R,Yan SF,Schmidt AM,Methylglyoxal comes of AGE. Cell,2006,124(2):258-60..

[3] Chen YL,Zhuang XD,Xu ZW,et al.Higenamine Combined with 6-Gingerol Suppresses Doxorubicin-Triggered Oxidative Stress and Apoptosis in Cardiomyocytes via Upregulation of PI3K/Akt Pathway,Evid Based Complement Alternat Med.2013;2013:970490.

[4] Dronavalli S,Duka I,Bakris GL,The pathogenesis of diabetic nephropathy,Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2008,4(8):444-52.

[5] McLellan AC,Thornalley PJ,Benn J,et al.glyoxalase system in clinical diabetes mellitus and corelation with diabetic complications.Clin Sci (Lond),1994,87(1):21-9.

6- gingerol protects HK-2 cells against injury induced by methylglyoxal

CHEN Yan-ling, LUO Ting, WU Xiu-xiang, FAN dong, LI Hai-zhou, ZENG Hong-min, KANG Yi,WANG Xiao-ling, HUANG Shuang-zhi
(Department of Pathophysiology, Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Guangdong Zhuhai 519041, China)

ObjectiveTo observe the protective effect of 6- gingerol on the injury of HK-2 cells induced by methylglyoxal.MethodsHK-2 cells were incubated with 400μmol/L methylglyoxal for 24h and treated with different concentrations of 6- gingerol (1,10,50,100,200μmol/L).Cell viability was measured by CCK-8 assay.The morphological changes in apoptotic cells were evaluated by DAPI.The protein level of activated caspase-3 was tested by western blot.ResultsCompared with control group, cell viability of HK-2 cells were significant reduced by methylglyoxal;moreover,the apoptotic cells and protein level of activated caspase-3 was increased after incubated with methylglyoxal, which was inhibited by treatment of 6- gingerol.Conclusion6- gingerol had a protective effect on HK-2 cells against the injuries induced by methylglyoxal through raising cell viability and inhibiting apoptosis.

6- ginger phenol; acetone aldehyde; HK-2 cell

R285.5

A

ISSN.2095-8242.2017.057.11095.03

国家自然科学基金资助项目（NO.：81560133）；贵州省科技合作计划项目（NO.：黔科合LH字[2015]7529号）；遵义医学院博士科研启动基金

陈燕玲，E-mail：546475534@qq.com

本文编辑：赵小龙