人工光照对青春期前雌性大鼠生殖系统发育的影响

张宁，郑群，傅晓艳，郭方明，张志琴，汤碧娥，唐风君，陈浩浩*

（1金华职业技术学院医学院生理学教研室，金华321007；2金华职业技术学院附属医院生殖医学中心，金华321000； 3金华职业技术学院医学院不孕症研究所，金华321007）

人工光照对青春期前雌性大鼠生殖系统发育的影响

张宁1,3，郑群2，傅晓艳3，郭方明1，张志琴1，汤碧娥1，唐风君1，陈浩浩3*

（1金华职业技术学院医学院生理学教研室，金华321007；2金华职业技术学院附属医院生殖医学中心，金华321000；3金华职业技术学院医学院不孕症研究所，金华321007）

目的研究人工光照时长对青春期前雌性大鼠生殖系统发育的影响。方法选取40只离乳后（日龄为21天）的SPF级雌性大鼠，随机分成对照组、16h光照组、20h光照组、24h持续光照组，每组10只。各组均正常饮食，持续28天。阴道涂片法检测动情周期，计算卵巢和子宫脏器系数，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中褪黑素（MT）、卵泡刺激素（FSH）雌二醇（E2）水平，HE染色显微镜下观察卵巢和子宫组织形态学的改变。结果与对照组相比，24h持续光照组动情期延长，卵巢和子宫脏器系数升高，MT下降，E2水平增高，可见成熟卵泡和排卵后黄体；除20h光照组偶见少量成熟卵泡外，16h光照组和20h光照组卵巢和子宫脏器系数和血清激素水平未见明显改变。结论一定范围内延长光照对雌性大鼠生殖系统发育无显著影响，但24h持续人工光照可以导致青春期前雌性大鼠性发育提前，这可能与体内MT水平抑制有关。

光照；青春期前；雌性大鼠；褪黑素；性发育

性早熟是指女孩在8岁、男孩在9岁以前呈现第二性征[1]，是小儿临床最常见的内分泌疾病之一。女性卵巢的发育受下丘脑-腺垂体的调节，在青春期前，下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）神经元尚未发育成熟，GnRH的分泌很少，卵巢激素处于低水平状态。随着青春期的到来，下丘脑GnRH神经元逐渐发育，GnRH的分泌增加，下丘脑-腺垂体-性腺轴（hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPGA）启动，卵巢功能开始出现周期性的变化。褪黑素（melatonin,MT）是松果体分泌的主要激素之一，分泌呈现明显的日周期变化，白天分泌减少，夜晚分泌增多，而且与年龄负相关，随着年龄增长，MT分泌量逐渐减少[2]。人在出生后数月即可有MT分泌，3～6岁达最高峰，7～10岁起松果体开始逐渐退化，褪黑激素分泌减少，松果体退化的年龄刚好和青春发育期开始的年龄相吻合。有文献报道[3,4]，光照信号依靠褪黑素介导传递到HPGA来调节性成熟及生殖活动，光照过强及过长，可能导致性早熟。随着社会发展，女童性早熟发病率逐年增高，这可能与女童儿童期暴露光照增多，导致松果体分泌褪黑素减少，对下丘脑-腺垂体-性腺轴的抑制作用减弱，导致青春期性发育提前有关[5,6]。本研究探讨过度光照对青春期前雌性大鼠生殖系统发育的影响，为今后对性早熟的预防和治疗提供理论依据。

材料与方法

1 实验材料

SPF级21日龄健康雌性SD大鼠40只，体重50±1.62g，由浙江省实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（浙）2014-0001。自制光照控制箱（箱体长、宽、高均为1.5m，箱顶安装普通居民用市售日光灯4只，功率为60w），ELISA试剂盒购自武汉华美生物生物工程有限公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2 动物分组

大鼠适应性饲养2天后，按照标准随机化原则，分为对照组、16h光照组、20h光照组和24h光照组，每组10只。除对照组外，其他各组均饲养在光照控制箱内。①对照组：12h光照，12h黑暗。②16h光照组：暴露周期（h）为光∶暗=16∶8。③20h光照组：暴露周期（h）为光∶暗=20∶4。④24h持续光照组：暴露周期（h）为光∶暗=24∶0。各组均正常饮食，持续4周。

3 动情周期观察

大鼠阴门开启后，每天上午8∶00进行阴道涂片，用沾有生理盐水的细棉签在大鼠的阴道内轻旋 2圈，然后均匀涂在干净的载玻片上， 在显微镜下观察阴道脱落细胞的形态，判断各组大鼠的动情周期。雌性大鼠动情周期可以分为4期：①动情前期，有核上皮细胞占绝大多数，偶有少量角化细胞和白细胞；②动情期，无核角化细胞占绝大多数，偶有少量有核上皮细胞；③动情后期，有核上皮细胞、角化细胞、白细胞均有，且所占比例基本均等；④动情间期，可见大量白细胞，少量有核退化的上皮细胞和些许粘液。

4 血中性激素水平检测

各组大鼠眼球取血2～3ml室温下静置，3000r/min离心20min，分离血清，置于-20℃冰箱冷冻保存。采用ELISA法检测血清中MT、FSH、E2水平，具体步骤参照试剂盒说明书。

5 器官系数测定

采血后脱颈处死大鼠，打开腹腔，摘取其子宫和卵巢，剥去其周围的脂肪和结缔组织后称重，然后立即置于4%多聚甲醛中固定，计算子宫和卵巢的脏器系数(器官湿重/体重)。

6 卵巢和子宫组织形态学观察

每组随机选取5个卵巢和子宫进行常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察并计数。

7 统计学方法

所有实验数据采用SPSS17.0统计软件进行分析处理。所有数据均采用平均值±标准差(±s) 表示，对数据首先进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性的两组间数据分析采用独立样本t检验分析，多组间数据分析采用重复测量设计的方差分析。 P＜0.05表明具有统计学显著的差异。

结 果

1 4周24h持续光照使大鼠动情周期延长

动情周期各时期阴道脱落细胞典型涂片显示（图1）： ①动情前期，有核上皮细胞占绝大多数，偶有少量角化细胞和白细胞；②动情期，无核角化细胞占绝大多数，偶有少量有核上皮细胞；③动情后期，有核上皮细胞、角化细胞、白细胞均有，且所占比例基本均等；④动情间期，可见大量白细胞，少量有核退化的上皮细胞和些许粘液。对照组和16h光照组大鼠阴道涂片未见动情期；20h光照组偶见动情期但无规律的动情周期；24h持续光照组动情期延长，持续时间长短不一，动情周期明显延长约6～8d。各组未见细胞形态的明显变化。

2 4周24h持续光照使血清褪黑素降低雌二醇升高

24h持续光照4周大鼠血清中褪黑素（MT）较对照组显著降低，血清中雌二醇（E2）较对照组显著升高，其他组与对照组相比无显著差异。各组血清卵泡刺激素（FSH）比较无统计学差异（表1）。

图1 大鼠动情周期各时期阴道脱落细胞形态。A，动情前期；B，动情期；C，动情后期；D，动情间期；标尺，100μmFig. 1 Morphology of the vaginal exfoliated cells from rats during estrous cycle. A, proestrus phase; B, estrus phase; C, metestrus phase; D, anestrus phase; scale bar, 100μm

表1 光照大鼠血清性激素水平Tab. 1 Serum concentrations of sex hormones in the experimental rats

3 长时间光照升高子宫和卵巢系数

16h光照组大鼠子宫系数和卵巢系数均无变化；20h光照组大鼠的子宫系数与对照组相比明显升高，卵巢系数无明显变化；24h持续光照组大鼠的子宫和卵巢系数与对照组相比均明显升高（表2）。

表2 光照大鼠子宫系数和卵巢系数Tab. 2 The ovary and uterus indexes of the experimental rats

4 长时间光照使子宫和卵巢发育提前

HE染色结果显示（图2）：对照组和16h光照组大鼠子宫宫腔小，肌层薄，少见腺体；与对照组相比，20小时光照组子宫宫腔增大，肌层增厚；24h持续光照组大鼠子宫肌层增厚和宫腔增大更明显，腺体增多，腺腔更大。对照组可见大量的初级卵泡，未见次级卵泡和成熟卵泡。16h光照组大鼠卵巢内可见大小不等的生长卵泡，初级卵泡和次级卵泡，未见成熟卵泡；20h光照组偶见少量成熟卵泡；24h持续光照组大鼠卵巢内可见成熟卵泡，卵丘和黄体形态正常，细胞形态完整、 排列整齐、层次分明。

图2 光照大鼠子宫和卵巢组织学变化的HE染色观察。A-D，子宫；E-H，卵巢； A和E，对照组； B和F，16h光照组；C和G，20h光照组；D和H，24h光照组；比例尺，100μmFig. 2 HE staining examination on histological changes of the uterus and ovary of the rats. A-D, Uterus; E-H, Ovary; A and E, Control group; B and F,16-hour light exposure group; C and G, 20-hour light exposure group; D and H, 24-hour light exposure group; scale bar, 100μm

讨 论

青春发育的启动过程受下丘脑-腺垂体-性腺轴的调节，调节该轴的环节发生异常，即可引起青春发育的异常。性早熟的发生与下丘脑-腺垂体-性腺轴提前启动有关。青春发育的启动与褪黑素的关系已经得到许多专家和学者研究，并形成一定共识。临床研究表明[7-9]，中枢性性早熟儿童夜间血清MT和性发育水平相关，在性早熟儿童中，血清MT水平明显低于年龄相当的对照组，且与正常青春期组无差异，这与在青春期前褪黑素抑制下丘脑释放GnRH、当褪黑素分泌不足时下丘脑GnRH分泌量增加所引起真性性早熟的报道一致。

有研究发现[10]，过度的光照可以抑制松果体功能，形成了松果体的光切除状态，使得MT分泌受到抑制，导致MT的对HPGA的抑制作用减弱，性发育提前。MT作为青春发育的抑制性神经递质，在下丘脑-腺垂体-性腺轴(HPGA)各个水平发挥抑制作用，推测其可能机制为下丘脑、垂体、卵巢存在MT受体，MT可以与下丘脑、垂体MT受体结合，阻断GnRH神经元的分泌释放GnRH，抑制垂体分泌FSH、LH和PRL[11-13]。同时MT能促进下丘脑促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）的释放，GnIH与血清中LH水平呈现负相关，对性腺具有抑制作用[14]。动物实验也发现[3]，MT对下丘脑-腺垂体的作用仅出现在未成熟大鼠，而对性成熟大鼠无此作用。

本研究发现，正常组和16h光照组动情周期、脏器系数和血清激素水平无明显改变；20h光照组动情周期中可见动情期，但无规律的动情周期，子宫系数升高，其他无明显改变；而24h持续光照组大鼠动情周期中的动情期延长，血清MT水平明显下降，E2水平明显增高，子宫和卵巢发育与空白对照组相比明显提前。该结果提示适量延长人工光照可能对性发育影响不大，但持续过量的人工光照能抑制松果体分泌MT，导致青春期前雌性大鼠下丘脑-腺垂体-性腺轴提前启动，性发育提前。随着城市化建设加快，女童接触人工光源增多，生活方式上被动接受过量人工光照，我们认为，女童增加适量人工光照对性发育无影响，但持续人工光照会导致性发育提前，甚至性早熟。

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Effects of artificial lighting on the development of reproductive system in preadolescent female rats

Zhang Ning1,3, Zhengqun2, Fu Xiaoyan3, Guo Fangming1, Zhang Zhiqin1, Tang Bi-E1, Tang Fengjun1, Chen Haohao3*
(1Department of physiology, School of Medicine, Jinhua Polytechnic Institute;2Center of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Jinhua Polytechnic Institute;3Institute of Infertility, School of Medicine, Jinhua Polytechnic Institute, Jinhua 321001, China)

ObjectiveTo investigate the effects of artificial lighting on the development of reproductive system in preadolescent female rats.MethodsForty healthy 21-day-old female rats in SPF grade were randomly divided into 4 groups (10 rats each)∶ control group and groups that were continuously exposed to light for 16, 20 or 24 hours on a daily basis. All rats were given normal diet. After 28 days, the pattern of vaginal cell exfoliation during the estrous cycle period was studied, and the organ indexes of ovary and uterus were calculated. The serum concentrations of melatonin (MT), estradiol (E2), follicle-stimulating hormone (FSH) were quantified by ELISA, and the histopathological lesion of uterus and ovary were observed with HE staining.ResultsCompared to control, rats in 24-hour light exposure group had a prolonged estrous cycle and increased organ indexes of ovary and uterus. Their serum concentrations of MT decreased while E2 increased. Mature follicles and corpus luteum after ovulation were visible. In contrast, 16-hour and 20-hour light exposure groups had no obvious changes on their reproductive activities.ConclusionThe moderately increased exposure to artificial lighting had no obvious effect on the development of reproductive system in preadolescent female rats, but 24 hour continuous exposure induced a premature development, which may be associated with the reduction of melatonin level.

Lighting; preadolescent; female rats; melatonin; sexual development

R363

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 004

2017-06-21

2017-10-08

金华市科技局计划项目（2016-4-012）；浙江省2016年度高校访问工程师“校企合作项目”（FG2016033）

张宁，女（1980年），汉族，讲师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：jhchh@aliyun.com