氟化钠-壳聚糖凝胶对乳牙釉质早期龋再矿化实验观察

周红艳 臧睿觉 王珏 刘茜 张晓旻 曹灵 梅予锋

氟化钠-壳聚糖凝胶对乳牙釉质早期龋再矿化实验观察

周红艳 臧睿觉 王珏 刘茜 张晓旻 曹灵 梅予锋

目的探讨氟化钠壳聚糖凝胶促进乳牙釉质早期龋模型再矿化的可行性。方法乳前牙试件使用乳酸羧甲基纤维素凝胶预处理，制备早期龋模型；早期龋的乳前牙试件随机分成4 组(n=6)，3 组分别进行氟化钠壳聚糖凝胶、壳聚糖空白凝胶、多乐氟处理，1 组作为空白对照，处理完成后进行pH循环，SEM、EDS检测循环完成后的试件表面。结果SEM观察，氟化钠壳聚糖凝胶能更好的保护釉质表层结构不受破坏，而多乐氟和空白对照组，则表现出釉质表层的崩解。同时氟化钠壳聚糖凝胶有更多的矿化物结晶在釉质表面形成。EDS检测钙离子的沉积比例，氟化钠壳聚糖凝胶组明显多于其余各组(P<0.05)。结论氟化钠壳聚糖凝胶可以提高乳前牙早期龋的再矿化水平。

壳聚糖水凝胶； 氟化钠； 乳牙； 早期龋； 再矿化

对于儿童牙病来说，早期龋的再矿化治疗是一项理想的微创治疗方法。促进再矿化的药物对于这一微创治疗来说是至关重要的。氟化物，CPP-ACP等都有很好的临床应用。本实验通过制备乳牙釉质早期龋模型，使用氟化钠壳聚糖凝胶处理后，进行pH循环的再矿化治疗，并通过SEM及EDS观察再矿化的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

乳前牙，南京医科大学附属口腔医院儿童牙病科拔出的乳前牙24 颗，已征得患儿及家长同意，要求乳前牙没有龋坏，磨耗量适中保证唇面釉质的大小，釉质表面没有裂纹，拔出时注意不要用力过猛，造成不必要的裂纹。

壳聚糖氟化钠凝胶(单位自制，正在申请专利)。

多乐氟(Sigma,美国),乙酸、无水氯化钙、磷酸二氢钾、羧甲基纤维素钠(AR，沪试)，HEPES(AR，Sigma),扫描电镜(JSM-6360LV)，能谱仪(GENESIS-2000XMS60)。

1.2 方法

1.2.1 釉质试件制备 选取拔除的乳前牙24 颗，用金刚砂平颈缘去除牙根，橡皮轮抛光釉质表面，三用枪冲洗表面30 s后，置于去离子水中，4 ℃冰箱保存。

存放24 h后，取出乳前牙，使用低速切割机切去厚约3 mm除唇侧釉质片。釉质片唇侧中央预留3 mm×3 mm的实验区域，其余部分用抗酸指甲油，涂3 遍，待指甲油干燥后，置于去离子水中，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 釉质试件处理 称取64.4 g羧甲基纤维素钠颗粒，7.46 ml乳酸，用1 L去离子水充分搅拌24 h，pH仪测定其pH值。取出釉质片，用吸水纸吸干表面水分，全部浸没在乳酸羧甲基纤维素钠凝胶中，放入37 ℃恒温箱48 h，制作早期龋模型。从凝胶中取出釉质片，三用枪冲洗1 min去除表面的凝胶后，置于去离子水4 ℃冰箱中备用。取早期龋模型的釉质片，随机分成4 组(n=6)，3 组分别进行药物涂布，均匀地涂上氟化钠壳聚糖凝胶，壳聚糖空白凝胶，多乐氟，每组涂布1 min, 静置4 h，另一组不处理作为空白对照。

1.2.3 pH循环实验 去离子水配制1 L含1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L KH2PO4及4.766 2 g HEPES的再矿化液，去离子水配制1 L含1.5 mmol/L CaCl2、0.9 mmol/L KH2PO4及50 mmol/L乙酸的脱矿液。

对各组釉质片每片进行pH循环处理，每次5 ml脱矿液3 h， 5 ml再矿化液21 h，换液之间，用去离子水冲净，吸水纸吸干。经过7 d的循环，取出釉质片，去离子水洗净，放入去离子水中4 ℃冰箱保存。

1.2.4 釉质试件再矿化检测 各组釉质片进行SEM及EDS测定，收集整理数据。

1.3 统计学处理

统计数据，SPSS 19软件统计分析。

2 结 果

2.1 SEM结果

各组再矿化后电镜显示，氟化钠壳聚糖凝胶组(图 1A、E)釉质表面结构粗糙，孔隙大部分被新生的矿物质结晶所堵塞，结晶结构相对统一，能看到明显的结晶形态。壳聚糖空白凝胶组(图 1B、F)釉质表面呈蜂窝状凹陷，大量的孔隙结构暴露，个别孔隙被结晶结构堵塞。多乐氟组(图 1C、G)釉质表面粗糙，有散在的不规则结晶结构，同时也能观察到不少孔隙。空白对照组(图 1D、H)釉质表面形态不规则、粗糙，大量的孔隙结构，少数的结晶结构。

2.2 EDS检测结果

图 1 各组再矿化后釉质表面 (SEM, A～D: ×1 000； E～H： ×1 500)

Fig 1 Enamel surface of the each group after remineralization

(SEM, A～D: ×1 000； E～H： ×1 500)

2.2.1 F元素、P元素、Ca元素方差分析 F、P的元素组间比较均无统计学意义(P>0.05)，Ca元素的单因素方差分析氟化钠壳聚糖凝胶组高于其余各组(P<0.05)，其余各组两两比较无统计学差异(表 1，图 2)。

图 2 各组样本F、P、Ca元素比例比较(%)

3 讨 论

早期龋的形成主要是釉质在细菌的酸性产物作用下，引起釉质晶体结构脱矿，羟基磷灰石的结构遭到破坏，钙磷等离子从中流失。最早期的表现就是釉质的颜色发生变化，呈现白垩色。这一变化，在临床治疗中经常能够见到。早期龋出现后，针对病症的治疗是当下研究的热点，控制早期的龋病不再发展，可抑制基质结构的崩塌这样不可逆的结果的发生[1]。Gurunathan[2]、Sköld-Larsson[3]等的实验指出了再矿化治疗釉质白色病损的机制和方法，这样的早期龋坏经过治疗是可逆的，因为唾液中的钙磷是处于饱和的平衡状态，脱矿的釉质在一天中是不断地和唾液接触，脱矿和再矿化对于釉质来说是一个每天不断进行的过程。

本项目另一部分实验研究证实本课题制作的氟化钠壳聚糖水凝胶为智能型凝胶，随温度升高凝胶由液相向胶体相的转变，在温度达到37 ℃时，8 min内迅速变成薄膜状紧密附着在牙面。pH值接近中性，生物相容性较好。作为大分子多糖，凝胶化后，提供的空间可以作为药物的良好载体。口腔局部用药，参考多乐氟这一口腔涂氟经典药物，4 h时的作用时间，可以达到70%多的药物释放量，可以充分地发挥药物的作用。因此本实验使用氟化钠壳聚糖温敏凝胶进行乳牙釉质早期龋再矿化研究是可行的。

氟化物可以促进釉质的再矿化这一理论早已被写进教科书，这是因为氟离子的大小与羟基接近，且结合能力强，可以置换羟基磷灰石中的羟基和碳酸根，并填补羟基磷灰石的一些离子空隙，形成的氟磷灰石稳定性更高，强度更大。本研究通过SEM可以直观的观察到釉质的表层结构，通过区分结构的变化说明处理对于釉质的作用。高洁等[58]的实验，通过扫描电镜观察乳切牙牙体结构，展示了正常乳切牙的釉质表面结构，釉质与牙本质的相接的结构，为乳牙的釉质形态观察展示了良好的办法。郭青玉[4]、金燕[5]、刘梅天[6]等指出SEM观察下，未处理时牙釉质的表面形态光滑,而酸蚀后的牙釉质表面呈现多孔的蜂窝状或鱼鳞状结构，这种酸蚀后描述上的差异可能与投照的角度有关，并指出了经过再矿化实验后釉质结构呈现散在的矿化结节，表面粗糙，这些实验支持了本实验观察到的结果。首先空白对照组，在单纯的pH值循环后出现少量的结晶结构散在釉质表面，表面结构粗糙，孔隙较多，说明再矿化作用不明显；多乐氟组的釉质表面观察到了更多的结晶结构，但仍为散在的分布于表面，表面粗糙，与光滑的釉质表面结构有所区别；而壳聚糖空白凝胶组，观察到的釉质表面结构为鳞片状的大量的孔隙结构，釉质表面在经过了pH值循环之后，只有少量的矿物质结晶的形成；氟化钠壳聚糖凝胶的SEM观察结果，显示了脱矿的孔隙周围在经过了pH值循环后大量的结晶结构排列并阻塞了釉质表面的孔隙。SEM的结果提示，壳聚糖凝胶可能渗透入釉质的脱矿孔隙中，釉柱的直径约4～6 μm，釉柱峭即釉柱间隙要小于这一宽度，壳聚糖凝胶这一高聚物的大分子结构可能仅能够渗透入酸蚀后的釉质孔隙中，这与本课题的另一实验结果，相呼应。

Arnaud的实验[7]指出单纯壳聚糖盐酸溶液能够渗透入正常釉质表面的孔隙当中形成屏障作用来达到抗酸蚀的作用，正常釉质表面的孔隙多来自釉柱间隙，本实验中壳聚糖凝胶表现为阻止了釉质孔隙结构与矿化液的接触没有形成矿化物结晶结构。同时壳聚糖凝胶在pH值循环后，釉质表面的结构和酸蚀后的蜂窝状结构极为相似，而多乐氟及空白对照组pH值循环后表面粗糙，散在的矿化物结晶，无类蜂窝状的结构；氟化钠壳聚糖凝胶则表现为大量的矿化物结晶阻塞孔隙，结晶结构为条索状，酸蚀后的蜂窝状结构也隐约可见，提示了与多乐氟相比氟化钠壳聚糖凝胶及壳聚糖凝胶有维持釉质表面结构不变的能力，这与当今的早期龋微创治疗原则不谋而合。Zhou等[8]通过AFM观察，酸蚀过后的釉质表面经过再矿化处理后，孔隙结构可以被结晶所填塞，矿化效果越好，其表面结构约趋于平坦；本实验中氟化钠壳聚糖凝胶SEM结果提示有大量的矿化物结晶形成，再矿化治疗的效果明显。

EDS，全称是energy dispersive spectrometer即能量色谱仪用来对材料微区成分元素种类与含量进行。电子轰击表面结构，散射出来的不同波普的X线经过收集，电脑处理，比较出这一区域的元素构成比，比例的不同，提示了酸蚀处理后釉质表面经过再矿化之后的元素变化。釉质表面的钙磷以及氟在一定程度上是成比例的，而且这一比例一般情况下不会发生变化，Peric的实验[9]也指出了EDS检测的元素比例即便在再矿化后没有显著性的差异。由本实验统计结果可知，氟及磷的元素含量在各组之间没有统计学差异，各组含量均值近似相等，这可能与氟化钠壳聚糖凝胶及多乐氟的药物在预处理完酸蚀后的釉质表面后即去除，而后经历了pH值循环，氟元素并没有更多的沉积在釉质表面有关，并且氟和磷达到了一个平衡值；钙元素的含量，氟化钠壳聚糖凝胶明显要高于多乐氟、壳聚糖空白水凝胶及空白对照组，这与SEM的观察结果是统一的，多乐氟、空白对照组都有少数结晶结构堵塞了釉质表面的孔隙结构，壳聚糖空白水凝胶则表现为孔隙暴露，没有更多的结晶结构形成，此三组都没有更多的Ca元素沉积，而氟化钠壳聚糖凝胶组有大量的矿化物结晶在孔隙周围形成阻塞了釉质酸蚀后的孔隙结构，所以EDS测定后有更多的Ca元素的沉积，Amaechi[10]用EDS检测也证明了Ca元素比例的变化。说明氟化钠壳聚糖凝胶相较于其他各组促进釉质再矿化的能力都要高。

氟化物作为治疗早期龋的经典药物，局部用氟的方法很多，但使用含氟凝胶后，可在牙齿表面形成一层半透明的薄膜，持续缓慢释放氟离子，同时此薄膜具有一定的粘接性，很难从牙齿表面去除[11]，不易脱落，并且由医生操作，不用担心因患者使用剂量的不合适而造成的中毒反应。Magalhães的研究[12]指出，多乐氟是一个酸性的凝胶，这一产品已经作为美国FDA的治疗和预防龋病的一个金标准。本实验所研制的氟化钠壳聚糖凝胶，实验结果表明用于治疗早期龋的效果优于多乐氟，而且壳聚糖水凝胶的生物相容性良好，配置的原料易获得，价格相对较便宜，这为氟化钠壳聚糖凝胶成为治疗早期龋的有效药物提供了良好的基础。

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Aninvitrostudyofre-mineralizationofenamelwithearlycariesinprimaryteethtreatedbyNaF-chitosangel

ZHOUHongyan1,ZANGRuijue2,WANGJue1,LIUQian1,ZHANGXiaomin1,CAOLing1,MEIYufeng1.

1. 210029,DepartmentofPediatricDentistry,NanjingStomatologicalHospital,JiangsuKeyLaboratoryofOralDiseases,NanjingMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofPediatricDentistry,AffiliatedHospitalofStomatology,NanjingMedicalUniversity

Objective: To estimate the remineralization of enamel of primary teeth with early caries protreated by NaF-chitosan gel.MethodsEarly stage caries was created on anterior primary teeth. The samples were divided into 4 groups randomly(n=6), and treated by NaF-chitosan gel, chitosan gel, duraphat and non-treatment(the control) respectively. Then all samples were underwent a 7 days pH cycle. Then samples were tested with SEM and EDS. Data were analyzed with SPSS 19.ResultsThe SEM data showed that chitosan gel protected the enamel surface from being ruined by erosion. NaF-chitosan gel group showed more mineral crystal formation on the enamel surface. The NaF-chitosan gel group showed more Ca remineralized on the enamel surface.ConclusionNaF-chitosan gel can increase the remineraliztion of on the anterior primary teeth with early stage caries.

Chitosangel;NaF;Primaryteeth;Remineralization

江苏省卫生计生委预防医学科研课题(编号： Y2015051)； 江苏高校品牌专业建设工程资助(编号： PPZY2015B163)

210029， 南京医科大学口腔疾病研究江苏省重点实验室, 南京医科大学口腔医学院儿童口腔科预防口腔科(周红艳 王珏 刘茜 张晓旻 曹灵 梅予锋)； 南京市口腔医院儿童口腔科(臧睿觉)

梅予锋 025-85031837 E-mail： yfmei@njmu.edu.cn

R780.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.026

(收稿： 2016-12-12 修回： 2017-06-02)