响应面优化超临界法萃取绿豆皮黄酮工艺

张杨，刘闯

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

响应面优化超临界法萃取绿豆皮黄酮工艺

张杨，刘闯*

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

采用超临界CO2技术萃取绿豆皮中黄酮类物质，通过单因素和响应面试验对超临界萃取绿豆皮黄酮工艺参数进行优化，结果表明：当萃取压力31 MPa、萃取温度47℃、萃取时间3.58 h、原料/夹带剂=1∶0.62（g/mL）时，绿豆皮黄酮的萃取率最高为87.64%。影响黄酮萃取率由强到弱的因素依次为萃取温度＞萃取压力＞萃取时间＞原料/夹带剂。

绿豆皮；黄酮；超临界法；萃取；响应面试验

绿豆作为主要的豆类，有着重要的地位作用，还可用于药物中[1-2]，能够起到消暑、抗氧化以及利尿的作用。在绿豆中，其含有大量的营养物质，如绿豆淀粉、绿豆蛋白以及绿豆皮中的黄酮类化合物成分，都具有重要的作用，而主要的是绿豆中活性成分黄酮类物质[3]，有研究表明，绿豆中黄酮类化合物能够抗氧化等功效，作为活性成分主要存在于绿豆皮中。目前，提取绿豆皮中黄酮的方法主要为有机溶剂法、研究深入的还有微波、超声波等辅助提取法[4-6]。超临界CO2萃取技术是新兴起的高新技术，其特点为节省人力物力，降低能耗，降低废水排放、无污染等[7-8]，在食品领域得到广泛应用[9-10]。食品行业发展迅速，绿豆开发应用的产品越来越多，产生的绿豆皮下脚料也越来越多，因此开发绿豆皮产品、对绿豆皮进行深加工以及提取绿豆皮功能成分就成为急需解决的问题，本试验以绿豆皮为试验材料，利用超临界CO2萃取绿豆皮黄酮，可对绿豆皮综合开发利用提供一定的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜绿豆皮干粉：安徽鑫海药业有限公司；芦丁标准品：上海康朗生物科技有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠：潍坊海之源化工有限公司（以上试剂均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

350 g型中药粉碎机：广州市番禺区立鹤五金交电商行；UTP-3000型电子分析天平：慈溪红钻衡器设备有限公司；721型可见分光光度计：北京华威兴业科技有限公司；HWS-26型电热恒温水浴锅：广州越特科学仪器有限公司；WE-30型超临界萃取仪：南通杜欣新能源科技有限公司。

1.3 绿豆皮黄酮提取工艺及测定方法[11-12]

取一定量绿豆皮，粉碎至160目，称取粉碎后绿豆皮粉样品3 kg，通过超临界设备萃取后常压过滤，将滤液移至50 mL容量瓶中，进行测定。测定方法参照参考文献[11-12]的方法进行。

1.4 超临界萃取绿豆皮黄酮的单因素试验

1.4.1 萃取压力对绿豆皮黄酮萃取率的影响

在萃取温度45℃、萃取时间3.5 h、原料/夹带剂为1∶0.6（g/mL）的条件下，以绿豆皮黄酮萃取率为考察指标，考核萃取压力 20、25、30、35、40 MPa 对绿豆皮黄酮萃取率的影响。

1.4.2 萃取温度对绿豆皮黄酮萃取率的影响

在萃取压力30 MPa、萃取时间3.5 h、原料/夹带剂为1∶0.6（g/mL）的条件下，以绿豆皮黄酮萃取率为考察指标，考核萃取温度 35、40、45、50、55 ℃对绿豆皮黄酮萃取率的影响。

1.4.3 萃取时间对绿豆皮黄酮萃取率的影响

在萃取压力30 MPa、萃取温度45℃、原料/夹带剂为1∶0.6（g/mL）的条件下，以绿豆皮黄酮萃取率为考察指标，考核萃取时间 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h 对绿豆皮黄酮萃取率的影响。

1.4.4 夹带剂用量对绿豆皮黄酮萃取率的影响

在萃取压力30 MPa、萃取温度45℃、萃取时间3.5 h的条件下，以绿豆皮黄酮萃取率为考察指标，以无水乙醇为夹带剂，考核原料/夹带剂为1∶0.4、1∶0.5、1 ∶0.6、1 ∶0.7、1 ∶0.8（g/mL）对绿豆皮黄酮萃取率的影响。

1.5 绿豆皮黄酮超临界萃取工艺的优化

根据单因素试验结果，以萃取压力（A），萃取温度（B），萃取时间（C）和原料/夹带剂（D）作为响应因素，以黄酮萃取率（Y）为响应值，设计四因素三水平的响应面试验，采用Design-Expert8.0.6软件及Box-Behnken中心设计原理，确定最佳工艺参数。试验设计因素水平见表1。

表1 Box-Behnken中心组合试验因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in the Box-Behnken experimental design

2 结果与分析

2.1 超临界萃取绿豆皮黄酮的单因素试验结果

2.1.1 萃取压力对绿豆皮黄酮萃取率的影响

萃取压力对绿豆皮黄酮萃取率的影响见图1。

全球性的气候问题以及极端天气、自然灾害的频繁发生常常导致我国部门农产品供应不足的现象，影响着我国农业持续健康发展。此外，我国的城市化、工业化进程的不断深化导致农业耕地的减少也一定程度上影响着农产品供应。经济的快速发展、人民生活水平的提高拉动了国内市场对农产品的需求。因此，由于国内外投资机构蓄意炒作而导致的农产品价格大幅度提升的现象时有发生，这一状况也在一定程度上影响着物价的持续走高。对此，政府必须要加大对我国农业生产的支持力度，在政策上，经济上都给予一定程度的扶持，保证我国市场农副产品的充足供应。

图1 萃取压力对绿豆皮黄酮萃取率的影响Fig.1 Effect of extraction pressure on the extraction rate of flavonoids from mung bean

根据图1能够得出，在萃取压力为20 MPa～30 MPa范围内，随着萃取压力的升高，绿豆皮黄酮萃取率逐渐提高，但当萃取压力由30 MPa升高到35 MPa后，萃取率逐渐下降，当萃取压力为30 MPa时，绿豆皮黄酮萃取率最高，原因可能是压力过大对黄酮造成了损失[13]。因此，选择萃取压力25、30、35 MPa为响应面研究水平。

2.1.2 萃取温度对绿豆皮黄酮萃取率的影响

萃取温度对绿豆皮黄酮萃取率的影响见图2。

图2 萃取温度对绿豆皮黄酮萃取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids from mung bean

根据图2可知，当萃取温度为35℃时，黄酮萃取率最低，随着萃取温度的升高，萃取率先升高后降低，当温度为45℃时，黄酮萃取率达到最高，原因可能是，当萃取温度过低时，较低的温度导致黄酮不能够完全溶出，温度过高对破坏黄酮类化合物。因此，选择40、45、50℃为响应面研究水平。

2.1.3 萃取时间对绿豆皮黄酮萃取率的影响

萃取时间对绿豆皮黄酮萃取率的影响见图3。

根据图3可知，当萃取时间较短，为2.5 h时，萃取率最低，当逐渐提高萃取时间，萃取率明显升高，当萃取时间达到3.5 h后，萃取率几乎不变，这说明绿豆皮中黄酮已完全被分离，故再提高萃取时间，萃取率也不会上升[14]，因此，选择萃取时间为 3.0、3.5、4.0 h 为响应面研究水平。

图3 萃取时间对绿豆皮黄酮萃取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids from mung bean

2.1.4 原料/夹带剂比例对绿豆皮黄酮萃取率的影响原料/夹带剂比例对萃取率的影响见图4。

图4 原料/夹带剂比例对萃取率的影响Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on extraction rate

根据图4可知，当原料/夹带剂为1∶0.4（g/mL）时，黄酮萃取率最低，随着夹带剂量的增大，萃取率先升高，当原料/夹带剂为 1 ∶0.6（g/mL）时，萃取率达到最高，继续增加夹带剂量后，萃取率几乎不变，原因可能是，当夹带剂过低时，较少的夹带剂导致萃取不彻底，当夹带剂达到一定量后，黄酮已经完全被提出，因此继续增大夹带剂量后萃取率几乎不变。因此，选择原料/夹带剂为 1 ∶0.5、1 ∶0.6、1 ∶0.7（g/mL）为响应面研究水平。

2.2 超临界萃取绿豆皮黄酮工艺参数的优化

2.2.1 数学模型的建立与显著性检验

采用Box-Benhnken中心组合试验设计，以单因素试验结果为基础，进行四因素三水平的RSM（response surface methodology）分析试验。考察萃取压力（A），萃取温度（B），萃取时间（C）和原料/夹带剂（D）对黄酮萃取率（Y）的影响，试验设计方案及结果见表2。

应用Design-Expert8.0.6软件将表2做出多元回归拟合、方差分析及显著性检验，能够得出黄酮萃取率作为目标函数，关于每个因素编码值二次回归方程如下：

表2 Box-Benhnken的中心组合试验设计及结果Table 2 Box-Benhnken central composite design arrangement and experimental results

将以上结果做出显著性检验，表3是方差分析结果，表4是可信度分析结果。

分析表 3、表 4，能够得出，此结果，p＜0.000 1，远小于0.01，表明此数据分析结果极显著，回归数学模型和实际测定数值能够完全拟合，实验误差较小，因此，能够利用此数学回归方程模拟实验结果，同时用它进行计算。R2=98.49%，理论值和实际测定的数值有很高的相关联性，表明此方程较可靠。在回归模型中，一次项 A、B，交互项 AC、BC，二次项 A2、B2、C2、D2，均表现出了极显著水平，交互项BD，一次项C，均表现出了显著水平。方差分析结果表明，影响黄酮萃取率由强到弱的因素为萃取温度＞萃取压力＞萃取时间＞原料/夹带剂。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

表4 回归模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

2.2.2 交互作用对黄酮萃取率影响的响应面分析

交互作用极显著因素响应面及等高线图见图5。

等高线是反应因素之间的相互作用的，能够从图中直接明显看出[15-16]。若等高线图中圆圈是椭圆，代表因素之间作用显著，若图是圆形，代表因素之间不显著。萃取压力与萃取时间、萃取温度与萃取时间交互情况极显著，具体表现为等高线中的图形呈明显的椭圆形，萃取温度与原料/夹带剂交互情况显著，等高线图呈现出椭圆，而萃取压力与萃取温度、萃取压力与原料/夹带剂、萃取时间与原料/夹带剂交互情况不显著，具体表现为等高线图几乎呈现为圆形。

图5 交互作用极显著因素响应面及等高线图Fig.5 Response surfaces and contour plots showing the interactive effects

2.2.3 优化挤出酶解复合法液化工艺参数

为了能够明确最优参数，要把回归数学方程对每个参数求一阶偏导数，并设其是0，得到四元一次方程如下：

求解得：A＝0.151、B＝0.327、C＝0.154、D＝0.204，即最佳工艺参数为萃取压力30.75MPa、萃取温度46.63℃、萃取时间 3.58 h、原料/夹带剂=1∶0.62（g/mL），在此参数下，黄酮萃取率是87.32%。为便于实际操作，将参数修正为萃取压力31 MPa、萃取温度47℃、萃取时间3.58 h、原料/夹带剂=1 ∶0.62（g/mL），采用此参数做 3次平行试验，黄酮萃取率是87.64%，实际测定值和理论预测值比较相近，表明此模型可优化萃取绿豆皮黄酮工艺。

3 结论

采用超临界CO2萃取技术萃取绿豆皮黄酮，通过单因素和响应面试验对超临界萃取绿豆皮黄酮工艺条件进行优化，最佳萃取条件为：萃取压力31 MPa、萃取温度 47℃、萃取时间 3.58 h、原料/夹带剂 =1∶0.62（g/mL），此条件下绿豆皮黄酮的萃取率为87.64%。方差分析结果表明，影响黄酮萃取率由强到弱的因素为萃取温度＞萃取压力＞萃取时间＞原料/夹带剂。

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Supercritical Extraction of Flavonoids from Mung Bean Skin by Response Surface Methodology

ZHANG Yang，LIU Chuang*
（College of Food Engineering，Jilin Agricultural Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Supercritical CO2extraction was used to extract flavonoids from mung bean hulls.The optimum conditions were as follows：extraction pressure 31 MPa，extraction temperature 47℃，extraction time 3.58 h and the ratio of raw material/entrainer=1 ∶0.62（g/mL）.Under these conditions，the extraction rate of flavonoids was 87.64%.The results of analysis of variance also showed that the factors influencing flavonoid extraction rate from strong to weak were extraction temperature＞ extraction pressure＞ extraction time＞ raw material/entrainer.

mung bean husk；flavonoids；supercritical method；extraction；response surface test

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.012

吉林农业科技学院大学生科技创新科研项目（吉农院合字[2016]第2016041号）

张杨（1996—），女（汉），本科在读，食品科学与工程专业。

*通信作者：刘闯，男，本科，研究方向：食品科学与体育运动学。

2017-01-10