准东油田萘降解菌群培养及菌群双加氧酶基因多态性分析

马鹏　杜雪柯　李文静

摘要：采用无机盐培养基，以萘为惟一的碳源物质對准东油田石油污染土壤中的萘降解菌进行液体富集培养。经过5次培养后，利用固体平板对获得菌群萘降解能力进行检测，同时利用HPLC对降解产物进行检测。离心收集富集培养基中的菌体，提取基因组DNA，基于Illumina Miseq测序平台对16S rRNA序列进行测序及生物信息学分析，同时采用萘双加酶基因通用引物对萘双加氧酶基因片段进行扩增、测序及分析。结果表明，含有萘的固体平板有清晰透明斑的出现；高效液相检测结果显示，萘被降解成小分子产物，证明液体培养基可富集培养获得萘降解菌群。萘降解菌群16S rRNA测序比对结果显示，富集培养获得菌群分属于5门9纲15目24科31属，共33种细菌。另外共获得萘双加氧酶基因片段11条，GenBank注册号为KY304819-KY304829。系统发育树结果显示，所获萘双加氧酶基因分为4个类群。通过HPLC及双加氧酶基因的分子检测，验证已从准东油田石油污染土壤当中富集培养获得萘降解菌群。

关键词：萘降解菌；高效液相色谱；细菌菌群；萘双加氧酶基因；淮东油田

中图分类号：Q938.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）19-3726-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.033

Abstract： According to the literature， liquid enrichment medium supplemented with naphthalene as the sole carbon was used to culture the naphthalene degrading microbial consortia from the contaminated soil in Xinjiang Zhundong oilfield. After 5 repeated cultivation， the degradation ability of microbial consortia was detected by the clarity circle method on plate， and the degradation products were detected by HPLC. In addition， the enriched microbial consortia were collected by centrifugation. The genomic DNA were isolated from the microbial consortia and the 16S rRNA gene was amplified and sequenced based on Illumina Miseq sequencing platform. Besides， the the naphthalene dioxygenase genes were amplified with universal primers for sequencing and bioinformatics analysising. The 16S rRNA sequencing results showed that the enriched microbial consortia were divided into 5 phyla， 9 classes， 15 orders， 24 families， 31 genera and 33 species. In addition， a total of 11 naphthalene dioxygenase gene segments were obtained and GenBank accession numbers were KY304819-KY304829， which could be divided into 4 clusters by phylogenetic analysis. Through the HPLC and naphthalene dioxygenase gene molecular detection proved that naphthalene degrading microbial flora have been obtained through the liquid enrichment culture.

Key words： naphthalene degrading bacteria；high performance liquid chromatography；microbial consortia；naphthalene dioxygenase gene；Zhundong Oilfield

石油是一种重要的化石能源物质，在其带来巨大经济效益的同时，也对生态环境造成了严重影响，石油化工产品生产过程中的泄漏以及不完全燃烧进入环境造成的有机污染已有报道[1]。多环芳香烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指具有两个或两个以上苯环的一类碳氢化合物，是进入环境中的有机污染物危害最大的一类物质，污染物面积和浓度在逐年增加，已严重威胁到人类的身体健康[2]。该家族包括150多种成员，如萘、蒽、菲、芘等，美国环境保护署已将其中的16种多环芳烃列为优先考虑污染物[3]，其中较高分子量（四环以上）的PAHs由于难以降解，因此其毒性可以在环境当中持续存在。石油渗漏到环境后会破坏原有土壤理化性质，尤其会降低土壤的渗透性，其中所含多环芳烃还会降低土壤微生物多样性，从而影响土壤酶活性，造成土壤肥力下降[4]。如果有机污染物渗漏至农田，其中多环芳烃还会随食物链进行积累，引发人体组织器官的癌变甚至器官的衰竭[5]。

微生物降解被认为是去除PAHs环境友好且成本低廉的有效手段[6]。分子量过大的PAHs需要不同微生物进行共代谢降解[7]，而萘作为分子结构简单的多环芳烃常被当作模式有机污染物进行研究，已获得多株萘降解能力的菌株[8]。微生物降解萘的代谢过程中的关键酶萘双加氧酶，其活性中心具有相对较小的结构上的保守性，加之能活化分子氧，因此它们的底物范围较为广泛，且不同菌株来源的萘双加氧酶的底物范围和催化性能的差异比较大[9]。萘双加氧酶基因也常被作为微生物是否具有萘降解的能力，或者不同土壤微生物菌群降解萘的潜力进行分子检测[10]。

萘双加氧酶催化能力差异较大，因此筛选高效降解菌进行污染物的原位修复仍是未来工作的重点[11]。本研究采集新疆准东油田石油污染沙质土壤作为研究对象，沙质土壤中营养物质缺乏，原油渗漏后所含烃能给微生物提供足够的碳源，沙质土壤中原核微生物多样性往往大于背景土壤[12]。因此，从原油污染的沙质土壤中更容易筛选到降解能力较强的菌株，目前该区域多环芳烃降解菌株鲜见报道。本研究通过液体富集培养获得萘降解微生物菌群，并通过16S rRNA测序分析及萘双加酶基因片段的克隆，分析从准东油田获得的萘降解菌群结构以及萘双加氧酶基因的多态性，以期为高效降解菌的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料 样本取自新疆准东油田采油区，采集了3份石油污染年限在5年以内的不同沙质土壤样品。剥去表层杂物，采集的土样装入无菌聚丙烯塑料袋中，实验室-4 ℃保存，等量混合3份土样备用。

1.1.2 培养基 萘降解菌液体富集培养基为无机盐基础培养基（MBS），由大量（90 mL）和微量元素 （1 mL）两部分组成。大量元素成分为1.0 g/L （NH4）2SO4，0.8 g/L K2HPO4、0.2 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.1 g/L CaCl2·2H2O、0.005 g/L FeSO4·7H2O；微量元素成分为0.039 9 g/L MnSO4·H2O、0.042 8 g/L ZnSO4·H2O、0.034 7 g/L （NH4）6Mo7O24·4H2O[13]、pH 7.0±0.2，121 ℃灭菌30 min。固体培养基添加1.5%的琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 萘降解菌的富集培养 称取10 g石油污染土壤加入91 mL的液体富集培养基中，加入0.05 g萘作为惟一碳源及能源物质，180 r/min、32 ℃避光培养7 d。培养结束后吸取10 mL液体富集培养液离心收集菌体，再加入灭菌培养基洗脱菌体，加入到新的液体培养基中（为了消除或减小最初石油污染土壤中所残存的碳源物质），继续培养7 d，重复5次，转接过程为无菌操作。高效液相色谱检测样本为液体培养96 h后的样本（外源添加萘肉眼不可见）。

1.2.2 萘降解菌降解能力的固体平板检测 液体富集培养结束后，吸取0.1 mL液体培养基，涂布于固体培养基平板上（固体培养基冷却后，再加入0.2 mL 0.5%的萘丙酮溶液，用玻璃涂布棒涂布均匀，无菌风吹干，涂布有萘的无机盐固体培养基表面呈磨砂状），置于32 ℃培养箱中倒置培养。

1.2.3 高效液相色谱法检测萘降解产物 利用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测萘降解菌群的降解产物。在液体培养基中加入15 mL的乙酸乙酯充分振荡，静置5 min，吸取有机相于干净的烧杯中，重复2次。将含降解产物的乙酸乙酯12 000 r/min离心3 min，将上清液转移至干净容器内，干燥后加1 mL的甲醇溶液进行溶解。测试条件：甲醇和水（体积比82∶18）为流动相，流动速度为1 mL/min，进样量为10 μL，检测波长为270 nm，C18柱，整个过程温度40 ℃[14]。

1.2.4 萘降解菌群多样性检测 离心收集5 mL菌液当中的菌体，采用生工生物工程（上海）股份有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取萘降解菌基因组DNA。委托上海美吉生物医藥科技有限公司利用Illumina Miseq测序平台进行细菌16S rRNA基因序列的测定工作，测序引物为515F（5′-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTT TRAGTTT-3′）[15]。测序结果利用Usearch软件将获得的DNA序列划分为不同的OTUs（Operational Taxonomic Units），将相似性高于97%以上的序列归为同一个OTU。采用Qiime平台使用silva数据库对萘降解菌在属的水平上统计每个样品的群落组成[16]。

1.2.5 萘双加氧酶基因片段的克隆分析

1）DNA提取及萘双加氧酶基因片段PCR扩增。离心收集5 mL富集培养菌液当中的菌体，采用生工生物工程（上海）股份有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取萘降解菌基因组DNA。采用萘双加氧酶基因（nah基因）的通用引物NAH-F（5′-CAA AARCACCTGATTYATGG-3′）、NAH-R（5′-AYRCG RGSGACTTCTTTCAA-3′），以微生物菌群总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件参照文献[17]的方法进行。为了消除PCR单次扩增的偏向性，平行扩增3个重复，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2）萘双加氧酶基因克隆文库构建与RFLP分型筛选阳性克隆子。将凝胶回收产物与pUC18 T载体连接，转E.coli DH5α感受态细胞，进行蓝/白斑筛选。从文库中随机挑取96个白斑，构建准东油田液体富集培养萘降解菌群中萘双加氧酶基因的克隆文库。

提取克隆文库质粒DNA作为模板，采用M13-F和M13-R引物对进行PCR扩增，反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保温。PCR扩增筛选的阳性克隆子PCR产物，用限制性内切酶Hha I、Rsa I和Hinf I进行酶切，酶切产物用2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，将不同RFLP条带相对应的克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析，测序并比对正确的DNA与氨基酸序列信息提交至GenBank数据库。

3）系统发育分析。将测序获得的萘双加氧酶基因序列在GenBank中进行Blast同源性比对，下载相似性最高的萘双加氧酶基因作为标准序列，用MEGA 5.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining）进行聚类分析，并构建系统进化树。利用该软件对萘双加氧酶氨基酸序列进行进化距离估计及分子钟假设的检验[18]。

2 结果与分析

2.1 菌体萘降解能力固体平板检测

每阶段液体富集培养结束后，肉眼观察可以明显看出，随着固体萘体积的缩小液体逐渐呈浑浊状态，三角瓶壁有菌苔出现，而对照仅含有萘的无机盐培养基，7 d后摇瓶中萘肉眼可见。吸取最后一次的富集培养液0.1 mL，均匀涂布于含萘固体培养基上，96 h后固体培养基中出现明显的透明斑（图1），推测是以萘为碳源的细菌在培养基上生长对萘进行吸收或分泌胞外酶降解萘，固体平板检测结果显示液体富集获得了萘降解菌株。

2.2 萘降解产物的高效液相检测

对第5次液体富集培养液再进行转接，96 h后进行高效液相检测，确认通过液体富集培养是否获得了萘降解菌，结果见图2、图3。萘标准品的保留时间为4.591 min，而液体富集培养液提取物在7.5 min时出现一个大的吸收峰，6.7 min时出现一个小吸收峰。HPLC试验结果证明，液体培养基中所添加的萘已被降解，产生了2个分子量小于萘的不同降解产物，而这2个组分的降解产物有待进一步研究及分析。

2.3 萘降解菌的分类学鉴定

采用RDP Classifier贝叶斯算法对97%相似水平的操作单元代表序列进行分类学分析，并在各个水平（门、纲、目、科、属、种）统计样品的群落组成。萘降解菌群均属于真细菌域，分属5门（Actinobacteria、Armatimonadetes、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria）9纲15目24科31属，共33种细菌。萘降解菌群在属水平上的分类情况如表1所示。

从表1可以看出，菌株百分比达到1%的只有7个属，分别为红球菌属（Rhodococcus）45.18%，申氏杆菌属（Shinella）19.58%，产碱菌科中一个未分类的属（Alcaligenaceae_unclassified）19.56%，根瘤菌属（Rhizobium）9.58%，丛毛单胞菌科中一个未分类的属（Comamonadaceae_unclassified）1.19%，金黄杆菌属（Chryseobacterium）1.11%，Arcticibacter属1.09%。其中近半数的降解菌属于红球菌属。

2.4 同源性比對分析

摇瓶nah基因克隆文库共获得萘双加氧酶基因片段11条，DNA序列信息与氨基酸序列信息提交至GenBank数据库，GenBank注册号为KY304819-KY304829。将获得的nah基因在GenBank中进行同源比对，比对结果如表2所示。分析结果显示，从准东油田石油污染土壤中以萘为惟一碳源的液体富集培养获得的萘双加氧酶基因丰度最高的仅3个类型，共占文库89%以上。编号为Y-nah14和Y-nah85的克隆同源比对相似性为92%和85%，表明准东油田石油污染土壤中可能蕴含着独特的萘降解菌株。

2.5 萘双加氧酶基因系统发育分析

将获得的11个萘双加氧酶基因序列在GenBank中进行Blast相似性比对，将相似性较高的序列作为标准序列，利用MEGA 5.0软件采用邻接法聚类分析构建系统发育树（图4）。系统发育树结果显示，从准东油田石油污染土壤中以萘为惟一碳源的液体富集培养获得的萘双加氧酶基因分为4个类群。第1类群含有5条序列，第4类群含有4条序列，其余两个类群各含有1条序列。第3类群和第4类群序列之间相似性低于91%外，其余类群两两之间相似性均低于83%。其中第1类群和第4类群各序列之间的相似性均高于98%。此外，萘双加氧酶Blast同源比对得分最高的序列多来自于石油污染土壤中免培养细菌，仅一条序列来自于Pseudomonas（假单胞菌属）菌株的萘双加氧酶基因。比对来源于免培养细菌nah基因标准序列，其中2条来自大庆油田石油污染土壤，相似性均高于98%（KJ371806、KJ371655），而试验获得的nah基因却与已发表的来源于克拉玛依油田nah基因序列信息相似性均低于97%[19]。

2.6 萘双加氧酶α亚基氨基酸序列分析

将萘双加氧酶基因序列翻译成氨基酸序列，使用ClustalX2软件进行序列多重比对，可以看出获得的11条萘双加氧酶基因，仅编码8条氨基酸序列，Y-nah2与Y-nah6，Y-nah33与Y-nah91和Y-nah1与Y-nah52编码的萘双加氧酶α亚基氨基酸序列相同（图5）。

将所获的萘双加氧酶氨基酸序列进行分子钟假设的检验，发现来源于准东油田石油污染土壤的萘双加氧酶为同一起源，Y-nah1所在分支进化速度较快（图6）。

3 结论

石油成分复杂，并随产地不同其所含各种烃类的结构和所占比例相差很大，渗漏后会产生其独特的有机污染物降解菌群。如果能从中筛选特定有机物降解菌群进行污染物的原位修复，可避免采用外来菌株受到土著微生物的竞争捕食作用，因此，筛选广谱多底物降解高效菌仍是今后一段时间工作的热点。新疆储量丰富的石油、天然气资源已在中国经济建设中发挥重要作用，但在几十年的原油开采过程中，难免会有原油污染物随开采加工过程进入土壤。准东油田位于准噶尔盆地东部，采油区多与古尔班通古特沙漠重合。沙漠土壤微生态环境脆弱，因此原油污染极易改变其微生物菌群，并孕育特殊的污染物降解菌群，但目前鲜见针对新疆准东油田开展的原油污染土壤中芳香烃降解酶基因多态性以及石油污染土壤中不同污染物降解菌株分离的研究报道。

本研究选择萘作为限制性培养因子，是因为萘相对稠环芳香烃类化合物，挥发性和极性较大，增加了其与菌株接触的几率；另外，苯环越少相对越容易降解，因而其相应的代谢菌株比较容易获得。本研究结果可为进一步分离萘降解菌单菌株提供菌株分类信息以及功能基因序列信息，并为进一步富集培养获得不同石油污染物降解菌提供方法上的借鉴。

液体培养基富集培养液状态观察、菌群降解能力固体平板检测以及HPLC检测结果均显示，准东油田石油污染土壤当中的确含有萘降解菌株，且具有较高的降解能力。这些萘降解菌株是可以通过液体富集培养获得的，并且可以通过固体平板获得萘降解的单菌株，推测获得的萘降解單菌株含有降解萘功能基因的完整基因簇，能独立降解萘。从萘降解菌群多样性测序结果来看，菌株相对含量百分比达到1%的有7个属，而从液体富集培养基中克隆的萘双加氧酶基因片段却有11条，氨基酸序列为8条，这提示后续试验应该将nah基因作为筛选单菌落的一个标准，从而更多地获得萘降解单菌株。

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