玉竹不定芽的诱导与增殖研究

赵春莉　霍妍　刘子平

摘要：以玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]根茎、茎段、叶片为外植体，研究了玉竹不定芽的诱导和增殖体系。结果表明，最适宜外植体的灭菌时间为75%的乙醇处理10 s配合0.1%的HgCl2处理7 min，其污染率为13.3%；最适宜的外植体为根茎，成活率为90%；经过7 d的4 ℃低温处理的外植体，比未经处理的分化率高出了24个百分点；在玉竹增殖培养中，最适增殖培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L，最适宜增殖培养的蔗糖浓度为30 g/L，分化率达到了86.7%，并且植株生长状态良好，植株健壮。

关键词：玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]；不定芽；根茎；增殖

中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）19-3679-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.021

Abstract： The rhizomes，stems and leaves of Polygonatum odoratum （Mill.） Druce were used as explants to study the adventitious bud induction and propagation. The results showed that，the optimum time for sterilization of explants was ten seconds by 75% alcohol then treated seven minutes with 0.1% mercuric chloride，the pollution rate was only 13.3%. The survival rate of roots as optimum explants was 90%； after cold treatment for seven days of 4 ℃，differentiation rate of the explants was 24 percentage point higher than untreated explants. The optimum medium was MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L in the proliferation culture of P. odoratum （Mill.） Druce. The optimum sucrose concentration was 30 g/L，the differentiation rate reached 86.7%，and the plant growth status was stronger.

Key words： Polygonatum odoratum （Mill.） Druce； adventitious buds； rhizome； proliferation

玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]為百合科多年生草本植物，别名尾参、玉参、铃铛菜、甜根草[1]。其性微寒、味甘，具有润燥养阴、生津止渴的功效，并可用于口渴咽干、肺胃阴伤、内热消渴的治疗[2]。玉竹的药用价值十分丰富，其提纯物能增强人体的免疫力，煎剂服有扩张血管、抗衰老、抗心肌缺血、抗肿瘤的作用。玉竹不仅可以药食两用，还可以用于园林中，宜植于林下或建筑物遮阴处及林缘作为观赏地被植物，也可盆栽观赏[3-8]。由于玉竹的广泛应用，而野生玉竹的数量在逐年减少，且常规的繁殖方式繁殖速度慢，产量低，因此，探究玉竹快速的繁殖途径非常重要。

目前国内关于玉竹的研究较少。宁慧等[9]在玉竹组织培养与快速繁殖的研究中发现，其易于愈伤组织诱导的外植体为根状茎，尤其具有潜伏芽的根状茎段更有利于玉竹愈伤组织的诱导。由此可知，在玉竹的组织培养中，根状茎较适于作为外植体。宋艳梅等[10]用玉竹的花蕾和根茎作为外植体、宁慧等[9]用玉竹的根状茎作为外植体分别对玉竹进行了组织培养。而张卓等[11]发现在玉竹愈伤组织的诱导中，6-BA、NAA、2，4-D均有利于愈伤组织的诱导和不定芽的分化。本文对影响玉竹不定芽诱导和增殖的主要因素进行了研究，包括最佳灭菌方案、最适外植体、最适激素浓度配比等的研究，旨在找出玉竹组织培养的最佳方案，以期达到工厂化生产。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为吉林农业大学园林教学基地采集的玉竹完整植株，采集后选取无病虫害、无机械损伤、生长健壮的玉竹植株作为供试材料。

1.2 玉竹外植体的启动培养

1.2.1 外植体灭菌方法的筛选 将处理过的玉竹外植体先用流水冲洗表面浮土，接着用洗洁精清洗，再用流水冲洗3 h，最后用去离子水清洗干净后，放入超净工作台上的无菌烧杯中，用75%的乙醇浸泡，无菌水冲洗5～6次，再用0.1%的HgCl2消毒，无菌水冲洗5～6次，每次停留3 min，期间不断振荡。外植体的灭菌处理见表1。

1.2.2 最适外植体的筛选 选择玉竹的根茎、茎段以及叶片作为外植体，灭菌后，吸干表面水分，去除受损不健康的组织后，切取0.5～1.0 cm的小段，接种到MS培养基中，每个处理10个外植体，3次重复。给予相同的温度与光照，培养30 d后观察最适合组织培养的外植体，并记录其成活数与成活率。

1.2.3 低温处理诱导玉竹不定芽 取两份等量的玉竹茎段外植体，一半在4 ℃下处理，一半在常温下（未经低温处理），放置7 d后取出，分别接种到MS培养基中，每个处理10个外植体，3次重复，培养30 d后统计其不定芽的分化数、分化率以及幼苗长势，从中筛选出更有利于不定芽诱导的材料。

1.3 增殖培养

1.3.1 植物生长调节剂的配比 将新萌发的玉竹不定芽接种到继代增殖培养基上，以MS培养基为基本培养基，设置不同浓度植物生长调节剂6-BA与NAA浓度配比（表2）。每种处理10个不定芽，3次重复，30 d后观察并统计增殖芽总数、增殖系数以及幼苗长势。

1.3.2 蔗糖浓度的设置 将诱导出的不定芽接种到增殖培养基中，以MS培养基为基本培养基，分别添加不同浓度的蔗糖，设置10、20、30、40 g/L 4个浓度梯度。30 d后观察并比较不同蔗糖浓度对玉竹不定芽增殖的影响，统计并观察其分化数、分化率以及生长状态。

1.4 培养条件

在培养过程中，培养基中加入蔗糖30 g/L，琼脂12～13 g/L，pH 5.5～6.0，培养温度（23±2） ℃，光照时间24 h/d，光照度30～40 μmol/（m2·s），光源为日光灯。

1.5 数据计算

污染率=（污染的植株数/接种数）×100%；分化率=（分化芽外植体数/接种数）×100%；诱导率=（诱导芽外植体数/接种数）×100%；成活率=（外植体成活数/接种数）×100%。

2 结果与分析

2.1 玉竹外植体的启动培养结果

2.1.1 外植体消毒与灭菌方法的筛选结果 将清洗过的玉竹外植体按照表1的方法进行消毒灭菌，由表3可知，培养30 d后，处理A1、A4、A8全部污染死亡；处理A7的污染率最低，污染数量最少，成活的外植体数量最多，效果最好（图1）。

2.1.2 最适外植体的筛选结果 将玉竹的外植体（茎段、叶片、根茎）接种在MS培养基中，用表1中处理A7的方法进行消毒灭菌。其中茎段切成1 cm左右的小段，并保留腋芽，切除大部分叶片，插入培养基中；叶片切成1 cm2左右的方形，并用刀片将叶片垂直叶脉方向切割，注意不要切断叶片边缘，将叶背接触培养基，平铺在培养基中进行培养；根茎培养时，用剪刀减去根茎上的须根，切成0.5 cm左右的小段，切面接触培养基进行培养。由表4可知，培养30 d后，根茎外植体的成活率较高，达到了90.0%，并且生长情况良好（图2）。而茎段与叶片外植体的成活率较低，分别为43.3%和33.3%，未污染的外植体生长较慢或不生长（图3、图4）。由此可见，在玉竹的离体初代培养中，茎段是较好的外植体。

2.1.3 低温处理对诱导玉竹不定芽的影响 由表5可以看出，玉竹在经过4 ℃低温处理后，其诱导不定芽的分化率有所提高，且幼苗的长势也有所不同。未经低温处理（图5）的玉竹分化率为70%，在经过低温处理（图6）后其分化率升高到了94%，高出了24个百分点。由此可见，低温处理有利于玉竹不定芽的诱导和分化。

2.2 玉竹不定芽的增殖培养

2.2.1 不同浓度6-BA与NAA配比对玉竹增殖的影响 将诱导出的健壮无变异的玉竹不定芽移入到6-BA与NAA不同配比的培养基中，进行不定芽的继代增殖培养，培养30 d后统计并观察新增的不定芽。由表6可知，随着激素浓度配比的不同，其增殖率与增殖系数也呈现不同的结果，且其幼苗长势也呈现出了不同的状态。

在6-BA浓度为0.5 mg/L时，随着NAA浓度的增加，玉竹的增殖率与增殖系数也逐渐增大，并且幼苗的长势也逐渐好转。当6-BA的浓度为0.5 mg/L，NAA浓度为0.8 mg/L时，玉竹幼苗的长势最好（图7），并且增殖的幼苗全部为有效苗，植株健壮，叶色翠绿。在6-BA浓度为1.0 mg/L时，随着NAA浓度的增大，玉竹不定芽的增殖率与增殖系数也在不断增大，玉竹幼苗的生长情况由较差变为良好，其中在NAA浓度为0.4 mg/L时，生长状况较好，但出现了幼苗徒长，增殖苗的有效率较低，所以，综合因素考虑，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L（处理B4）为玉竹增殖最佳的激素组合。

2.2.2 蔗糖浓度对玉竹增殖的影响 将诱导出的玉竹不定芽接种到不同蔗糖浓度的增殖培养基中，培养基以MS为基本培养基，增殖结果见表7。从表7可以看出，蔗糖浓度对玉竹的增殖起着不同的调节作用，随着培养基中蔗糖浓度的增加，玉竹的分化数与分化率呈现先上升后下降的趋势。当蔗糖浓度为10 g/L时，玉竹幼苗不定芽的分化数较少，且植株生长不健壮，叶色枯黄（图8）；当蔗糖浓度为20 g/L时，玉竹幼苗的分化数与分化率有所增加，但植株生长情况一般，出现了植株徒长的现象（图9）；当蔗糖浓度为30 g/L时，玉竹不定芽产生的数量最多，其分化数为26，分化率达到了86.7%，此时不定芽的生长情况最好，植株健壮，叶色翠绿（图10），且诱导出的不定芽均为有效苗；当蔗糖浓度为40 g/L时，幼苗植株虽然生长健壮（图11），但其分化数与分化率有所下降，且幼苗生长过快，不利于下一步的培养。由此可得出，蔗糖含量为30 g/L时更加有利于玉竹的增殖培养。

3 小结

在组织培养中，植株不同的部位作为外植体可能对培养效果有着至关重要的影响。试验取玉竹的根茎、茎段以及叶片作为外植体，在相同培养条件下根茎的成活率最高；在玉竹的初代培养中，根茎是作为其初代培养最适宜的外植体，这与宁慧等[9]的研究结果一致。

低温处理对一些植物的诱导有时起着促进作用，本研究中，将采集处理后的玉竹植株放入4 ℃冰箱中保存7 d，得到经过低温处理的分化率及幼苗的长势要好于未经处理的植株。分析其原因可能是低温时玉竹外植体提前分化出幼芽，还有可能是经过低温的处理后，玉竹本身携带的抑制发芽的物质被打破，从而促进了发芽。

糖是植物组织培养中不可缺少的碳源，试验通过不同糖浓度的研究发现其添加的量同样影响着玉竹的生长发育，但研究表明糖浓度必须要维持在一定的范围内，才能起到很好的增殖效果。因此，在玉竹的离体快速繁殖中，为提高繁殖效率，在培养基的成分选择中，不单单要考虑生长调节剂的配比，还可从蔗糖的使用浓度上着手。

参考文献：

[1] TAKAGI H，SHIMOFOSA S，KANNO Y. Promotion of seed germination in Polygonatum odoratum and P. macranthum[J].Bulletin of Yamagata University Agriculture Science，2006，15（1）：1-10.

[2] 国家药典委员会.中国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.78-79.

[3] 王 琴，張 虹，王洪泉.黄精及玉竹中甾体苷成分的研究[J].中国临床医药，2003，4（2）：75-77.

[4] 林厚文，韩公羽，廖时萱.中药玉竹有效成分研究[J].药学学报，1994，29（3）：215-222.

[5] 胡润生.几种植物药降血糖活性的研究[J].国外医药（植物药分册），1995（3）：115-117.

[6] 加藤笃.中药玉竹的降血糖作用[J].国外医药（中医中药分册），1991（6）：36-38.

[7] 丁登峰，向大雄，刘 韶，等.玉竹多糖的提取及其对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠血糖的影响[J].中南药学，2005，3（4）：222-223.

[8] 杨立平.玉竹总苷对大鼠血流动力学的影响[J].湖南中医药导报，2004，10（4）：68-69.

[9] 宁 慧，杨培君.玉竹的组织培养与快速繁殖[J].西北植物学报，2009，29（11）：2339-2344.

[10] 宋艳梅，李 峰.玉竹组织培养研究[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（5）：62-63.

[11] 张 卓，姜 巍，张巍巍，等.小玉竹组织培养及无性系的建立[J].河南农业科学，2008，37（3）：92-95.